[发明专利]一种干细胞制剂的制备方法

说明书

本发明公开了一种干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：选取脐带样品、脐带样品处理、设置初始培养基、设置完整培养基、离心收集细胞悬液、细胞悬液再培养、加入血白蛋白等等。本发明与现有技术相比的优点在于：本发明提供的干细胞制剂的制备方法的P4代脐带间充质干细胞具有细胞数量多且表型稳定，用细胞筛过滤细胞制剂，将成团细胞过滤掉，防止细胞成团，大大提高了细胞活率。

技术领域

本发明涉及免疫细胞细胞实验领域，具体是指一种干细胞制剂的制备方法。

背景技术

近来，脐带间充质干细胞成为研究的热点。脐带MSCs来源广泛，易获得，并具有MSCs的所有特性。与骨髓来源的MSCs进行对比，脐带间充质干细胞更高水平表达CD146，一种代表MSCs的多向分化能力的标志物，且分化增殖能力更强。脐带间充质干细胞在慢性脊髓损伤的临床治疗研究结果显示，接受治疗的患者改善明显，生活质量得到很大提高，而不良反应发生率低，是非常安全的治疗方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足之处，提供一种干细胞制剂的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、选取脐带样品，将脐带与胶体金、荧光定量PCR混合后，检测脐带血清成分；

步骤二、脐带样品处理，脐带样品从采集瓶中取出并置于无菌器皿中，用无菌手术剪剪成1-4cm的脐带小段样品后分别放入无菌烧杯中进行表面清洗，清洗完成后放入弯盘并用无菌手术剪剪成1-3mm的脐带小块样品，并将脐带小块样品均匀铺设在培养皿底部；

步骤三、设置初始培养基，将带有脐带小块样品的培养皿放入干燥箱干燥40min，拿出后向培养皿内放入富含15％添加物的培养基，保证每周更换一次培养基并在期间观察组织贴块边缘细胞生长情况，待多数组织块细胞爬出且每个块组织块周围的细胞生长至75％融合值时，进行脐带间充质干细胞的原代传代；

步骤四、设置完整培养基，观察步骤三中的间充质干细胞细胞传至P3代时，6500cells/cm²的密度接种于T175培养瓶中，加入35ml的DF12完全培养基；待细胞长至90％左右融合时，用10mL PBS缓冲液冲洗细胞表面3次；

步骤五、将步骤四的PBS缓冲液清理干净后加入5mL胰蛋白酶消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶覆盖瓶底，迅速在镜下观察，待细胞皱缩成球状时轻轻拍打培养瓶外侧使细胞漂浮起来；用移液管移取两倍胰蛋白酶量的培养基至培养皿中，终止消化；

步骤六、离心收集细胞悬液，选用1600rpm的离心机进行10min离心处理，选用移液管将离心后的上清液去除并用40mL生理盐水重悬细胞，得到细胞筛过滤细胞悬液；

步骤七、细胞悬液再培养，取0.4mL过滤后的细胞悬液，用血球计数板计数，计算所需细胞量的细胞悬液体积，并取1*106细胞悬液做流式，用注射器抽出与所需细胞悬液体积相等的生理盐水，将细胞悬液打回100mL生理盐水袋中，轻轻颠倒生理盐水袋混匀细胞；

步骤八、加入血白蛋白，分别在0h、4h计数，计算细胞活率；制剂在8℃条件下分别储存0h、2h、4h、6h、24h并计算相应的细胞活率。

本发明与现有技术相比的优点在于：本发明提供的干细胞制剂的制备方法的P4代脐带间充质干细胞具有细胞数量多且表型稳定，用细胞筛过滤细胞制剂，将成团细胞过滤掉，防止细胞成团，大大提高了细胞活率。

进一步的，步骤一的成分检测包括抗-HCV、HCV-RNA、抗-HDV、抗HEV、抗-HIV-1/2、HIV-1-RNA 及CMV-DNA。

进一步的，步骤二中选用PBS缓冲液对脐带小段样品内外进行反复冲洗，直至PBS缓冲液冲洗后无血色。