[发明专利]一种拟轮枝镰孢菌相关的ZmWAX基因的应用

权利要求书

1.一种拟轮枝镰孢菌相关的ZmWAX基因的应用，其特征在于，所述ZmWAX基因在玉米植株中过表达，提高所述玉米植株对拟轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides造成的茎腐病和种腐的抵抗能力；所述ZmWAX基因的全长编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ZmWAX基因的全长编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的一种拟轮枝镰孢菌相关的ZmWAX基因的应用，其特征在于，所述ZmWAX基因在玉米植株中过表达的方法为：

S1、用BamHI/SpeI双酶切pTF101.1-3×Flag载体，在温度为37℃的条件下酶切反应6h，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离，切下11.54Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到BamHI/SpeI双酶切pTF101.1-3×Flag载体的回收产物；所述酶切反应的体系为：BamHI酶1μL，SpeI酶1μL，Cutsmart buffer 5μL,pTF101.1-3×Flag载体10μL,灭菌超纯水补至50μL；

S2、以玉米自交系B73的cDNA文库为模板进行PCR扩增，将扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，切下1884bp大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到PCR回收产物；

所述PCR扩增的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F1μL、特异性引物R1μL、玉米自交系B73的cDNA文库1μL，灭菌超纯水补至20μL；所述特异性引物F的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，所述特异性引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述PCR扩增的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸40s，扩增40个循环；68℃延伸10min；

S3、用同源重组的方法将ZmWAX基因的全长编码区连接至pTF101.1-3×Flag载体的BamHI/SpeI之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到连接产物，将所述连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，利用质粒提取试剂盒，得到pTF101.1-ZmWAX载体质粒；

所述连接反应的体系为：2×HieffClone Enzyme Premix 5μL，S1中得到的BamHI/SpeI双酶切pTF101.1-3×Flag载体的回收产物2μL，S2中得到的PCR回收产物1μL,灭菌超纯水补至10μL；

所述ZmWAX基因的全长编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ZmWAX基因的全长编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

S4、转基因植株的获得：将S3中得到的pTF101.1-ZmWAX载体质粒导入农杆菌EHA105后，得到重组农杆菌，侵染玉米自交系B104的幼胚，将侵染后的幼胚诱导愈伤组织，再在含有草丁膦除草剂的培养基上分化出植株，得到转基因植株；

S5、转基因阳性植株的鉴定：利用载体框架上的引物Ubi-F和基因上的引物ZmWAX-R对S4中得到的转基因植株的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，出现750bp大小的条带的转基因植株为阳性转基因植株；

所述PCR扩增的体系为：2×KOD Mix 10μL，引物Ubi-F 1μL、引物ZmWAX-R 1μL、S4中得到的转基因植株的基因组DNA 1μL，灭菌超纯水补至20μL；

所述PCR扩增的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；

所述引物Ubi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述引物ZmW AX-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

S6、鉴定阳性转基因植株中ZmWAX的表达量：

S601、第一链cDNA的合成：提取S5中得到的阳性转基因植株的总RNA，测量所述总RNA的浓度，取1μg的所述总RNA用1μL的DNase I在37℃的条件下消化处理30min，然后在70℃的条件下加热10min，之后放置冰上，依照Promega反转录试剂盒的用量加入反转录所需试剂，42℃孵育1h，95℃变性5min后，将反应体系置于冰上，加入四倍体积的灭菌超纯水，得到第一链cDNA；

S602、qRT-PCR检测分析：

以S601中得到的第一链cDNA为模板进行PCR扩增；

所述PCR扩增的体系为：S601中得到的第一链cDNA 2μL、SYBR Green Master I酶预混液10μL、ZmWAX q-F引物1μL、ZmWAX q-R引物1μL、灭菌超纯水补至20μL；

所述ZmWAX q-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述引物ZmWAX q-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

并以玉米基因EF1A作为内参，所述玉米基因EF1A所使用的引物为EF1A q-F和EF1A q-R；

所述EF1A q-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述引物EF1Aq-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

计算S5中得到的阳性转基因植株中ZmWAX基因的相对表达值，相对表达值1，且与转化受体材料有显著性差异，为ZmWAX基因过表达转基因玉米植株。