[发明专利]一种β-半乳糖苷酶的突变体及其在牛奶中的应用

说明书

本发明公开了一种β‑半乳糖苷酶的突变体及其在牛奶中的应用，属于基因工程技术领域以及酶工程技术领域。本发明通过将来源于Aspergillus oryzae的β‑半乳糖苷酶第132位氨基酸突变为苯丙氨酸构建得到Y132F突变株，使得最适pH提升至5.5、受到产物抑制的程度低于野生型，并具有更好的乳糖水解效果，适于在食品加工等领域的应用。

技术领域

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶的突变体及其在牛奶中的应用，具体涉及利用重组米曲霉β-半乳糖苷酶突变体基因的毕赤酵母菌株产β-半乳糖苷酶来水解牛奶中的乳糖，属于基因工程技术领域以及酶工程技术领域。

背景技术

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，俗称乳糖酶，全称β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(EC3.2.1.23)。该酶在食品行业具有广泛的应用，是目前工业上生产无乳糖牛奶的主要用酶。目前全球大约有70％的人口患有乳糖不耐受，主要集中在亚洲和非洲，而目前我国乳糖不耐受人群占总人口的85％。无乳糖牛奶作为应对该病症的主要产品对于国民健康具有重要意义。

目前经FDA认证安全的可以用于食品行业的β-半乳糖苷酶主要来源于真菌，包括克鲁维酵母属和曲霉属。来源于克鲁维酵母属的中性β-半乳糖苷酶，是无乳糖牛奶生产的主要用酶，其在中性pH条件下具有很好的催化能力。但是，由于其无法胞外分泌，工业上在下游纯化步骤需要破碎菌体，工艺复杂成本高。因此亟需开发能够胞外分泌的中性β-半乳糖苷酶。目前中性β-半乳糖苷酶的主要几大供应商均来自于日本和荷兰，国内缺口较大。通过基因工程技术构建性能优良的β-半乳糖苷酶能够进一步降低工业成本，更好的弥补我国在乳品行业的缺口。

目前，已有不少针对克鲁维酵母β-半乳糖苷酶胞外释放方法的研究，包括构建渗透压敏感型酵母宿主以及将该中性β-半乳糖苷酶的部分片段和其他胞外分泌β-半乳糖苷酶的基因片段进行杂合等等。这些方法对克鲁维酵母β-半乳糖苷酶的胞外释放都几乎没有实质性的提升。

目前关于β-半乳糖苷酶的最适pH改造的研究很少，本发明所使用的来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-半乳糖苷酶，其最适pH在酸性，中性条件下催化乳糖水解的能力较低，目前在食品行业主要用于酸性乳清等废弃物处理。但是其具有良好的胞外分泌特性，如何提高其在中性条件下的水解活力，使其更适用于中性条件，将会有利于降低酶的工业生产成本。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种β-半乳糖苷酶及其突变体，该突变体是将米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-半乳糖苷酶(Genebank：XP_001727461.1)的氨基酸残基进行替换，通过基因工程手段将突变基因转化入毕赤酵母X33中，得到产β-半乳糖苷酶突变体的菌株。

本发明提供了一种β-半乳糖苷酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的β-半乳糖苷酶第132位取代得到的。

在一种实施方式中，将将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的β-半乳糖苷酶第132位的酪氨酸取代为苯丙氨酸。

在一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明他提供了携带所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。

优选地，所述表达载体为pPICZαA。

本发明提供了表达所述突变体、含有所述的基因或所述表达载体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括原核微生物和真核微生物。

优选地，所述微生物细胞以毕赤酵母为出发菌株。