[发明专利]一种基于人多能干细胞构建心脏类器官的方法

说明书

本发明公开了一种基于人多能干细胞构建心脏类器官的方法。本发明提供了基于人的多能干细胞构建心脏类器官的方法，包括如下步骤：1)将离体人的多能干细胞在不进行水凝胶包裹的条件下成球培养，得到人多能干细胞球；2)将所述人多能干细胞球依次进行第一次分化培养、第二次分化培养和第三次分化培养，即得到心脏类器官；本发明方法构建的心脏类器官中的心肌细胞组成比例与人心脏接近，构建的心脏类器官心肌细胞比例为34.1％，构建的心脏类器官具有类腔室结构以及分泌细胞外基质ECM；心脏类器官跳动收缩正常。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于人多能干细胞构建心脏类器官的方法。

背景技术

心脏类器官是体外构建的一类由多种心脏类型细胞组成的，与体内心脏高度相似的三维培养物,它能够模拟心脏的三维结构和生理功能。

人多能干细胞包括人胚胎干细胞以及人诱导多潜能干细胞，具有无限增殖能力，可以在体外分化为几乎所有人体细胞，包括心脏组成细胞。人多能干细胞是构建心脏类器官的理想种子细胞来源。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种基于人的多能干细胞构建心脏类器官的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将离体人的多能干细胞在不进行水凝胶包裹的条件下成球培养，得到人多能干细胞球；

2)将所述人多能干细胞球依次进行第一次分化培养、第二次分化培养和第三次分化培养，即得到心脏类器官；

在所述第一次分化培养和所述第二次分化培养前均包括将待培养细胞水凝胶包裹的步骤；

所述第一次分化培养采用的类器官分化培养基1，包括CHIR99021、B27和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐；

所述第二次分化培养采用的类器官分化培养基2，其包括KY02111、B27和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐；

所述第三次分化培养采用的类器官分化培养基3，其包包括B27和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠。

上述方法中，步骤1)中的所述成球培养为将所述离体人的多能干细胞在含有Y27632的细胞培养基中培养，得到干细胞球。

上述方法中，所述含有Y27632的细胞培养基由5-10微摩尔Y27632和干细胞培养基组成；

所述培养时间为24小时；

所述离体干细胞的数量为2500-50000个/孔。

上述方法中，所述类器官分化培养基1由5微摩尔CHIR99021、1％B27和550ug/mLL-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、细胞基础培养基组成；

所述类器官分化培养基2由5微摩尔KY02111、1％B27和550ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、细胞基础培养基组成；

所述类器官分化培养基3由1％B27和550ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、细胞基础培养基组成。

上述方法中，所述第一次分化培养的时间为48小时；

或，所述第二次分化培养的时间为48小时。

上述方法中，所述水凝胶为Matrgel；

所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导干细胞；在本发明中，胚胎干细胞为非全能干细胞，本发明中的胚胎干细胞为商购的胚胎干细胞，具体为胚胎干细胞H9。

由上述方法制备的心脏类器官也是本发明保护的范围。