[发明专利]一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法

说明书

本发明涉及一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法，所述纯化方法采用可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的金属氧化物微球或磁珠对细胞外囊泡进行纯化，纯化材料包括纳米二氧化锆微球、纳米二氧化钛微球或纳米三氧化二铝微球、纳米二氧化锆磁性微球、纳米二氧化钛磁性微球或纳米三氧化二铝磁性微球、多孔二氧化锆纳米微球、多孔二氧化钛纳米微球或多孔三氧化二铝纳米微球。本发明的纯化方法可以快速纯化多种样本：血清/血浆，尿液，细胞培养上清；通量适中，能够最大程度的保留细胞外囊泡，洗脱得到纯度较高的细胞外囊泡，不含螯合剂等可能影响后续实验的试剂。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法。

背景技术

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从10nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡（Microvesicles, MVs）和外泌体（Exosomes, Exs）组成，微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm – 1000nm。外泌体由细胞内的多泡小体（multivesicular bodies）与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为10nm- 200nm。EVs从大多数细胞类型分泌，并且存在于体液(包括血浆、血清、尿液和脑脊液)中。EVs可充当天然载体，用于在细胞之间递送大分子，包括蛋白、核酸(诸如DNA和RNA)、生物活性脂质和碳水化合物。已显示EVs信号传导在各种各样的生理和病理病况(包括致癌性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和代谢病症)中发挥重要作用。EVs表面含有从起源的细胞的表面继承的标志物(蛋白/碳水化合物)，允许对细胞和组织特异性EV进行分类和靶向。EVs内含物(包括但不限于蛋白和RNA)取决于其起源细胞，供体病理生理状态，细胞状况、诸如氧化应激或代谢应激以及供体对治疗干预的应答，且因此可以充当特定身体或疾病状况的生物标志物的来源。血液在全身循环，并且在临床实践中定期收集，使其成为疾病生物标志物的理想来源。血清和血浆，血液的液体和无细胞相，含有EV以及其他颗粒，循环的游离蛋白，循环的游离DNA和脂质。血浆样品中的某些组分(诸如白蛋白和补体系统)的丰度使得检测稀有代谢物和蛋白特别有挑战性。蛋白检测主要基于抗体-抗原相互作用，通常被称为免疫测定。传统的方法、如凝胶电泳(western印迹)和酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫化学发光以及较新的数字方法、如单分子阵列(Simoa)和Erenna使用该原理。免疫测定性能取决于抗体的质量(灵敏度和特异性)，与检测方法无关。抗体-抗原相互作用特性取决于抗体特异性和相互作用的环境，其包括：盐和蛋白的缓冲液浓度、pH和抗原的可用性。血浆和血清富含不同组分、诸如蛋白和代谢物，并且具有丰富蛋白的该复杂环境对于蛋白免疫测定而言是不良的环境，尤其是如果靶标分析物丰度较低。使用EVs需克服该问题，因为EVs或EVs的亚群的纯化将减少样品的复杂性，并且允许从样品检测低丰度的靶标或表位。此外，生物流体(诸如血浆或血清)中的RNA本质上是不稳定的，并且经受将其消化的各种类型的RNA酶。EVs携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现细胞外囊泡水平的升高，它们很有可能成为这类疾病的诊断标志物，因此，对细胞外囊泡进行准确的定性和定量研究显得尤为重要。

目前市场上大规模细胞外囊泡纯化的策略主要有两种：

切向流方式超滤，通过不同孔径的膜来浓缩样本细胞外囊泡，由于是物理过滤，所以只要是大于孔径的蛋白和其他可溶物都会被浓缩下来，会造成细胞外囊泡不纯，切向流超滤也会机械剪切损伤细胞外囊泡，导致细胞外囊泡破裂，使细胞外囊泡回收率会降低。