[发明专利]一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明提出了一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用，涉及生物技术领域。通过该方法构建得到的报告基因细胞系能够应用于肿瘤细胞、细胞凋亡、细胞模型、Caspase相关基因以及药物筛选等方面的研究。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

肿瘤的发生不仅仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是细胞凋亡异常的疾病。细胞的存活和凋亡之间是平衡的，这种平衡功能失调会增加患肿瘤的风险。而细胞凋亡(Apoptosis)是有机体为了维护自身内环境的稳定状态，而通过基因调控激活内源性核酸内切酶，由基因调控的细胞有序的，自主的程序化的死亡。目前已经确定半胱天冬蛋白酶(Caspase)在凋亡过程中是起着举足轻重的作用，同时，至少已有11种Caspase被发现，而Caspase分子间结构很相似，并且同源性很高，都同属于一个家族的蛋白酶。在这其中，Caspase8的活化在哺乳动物细胞的凋亡途径中表现尤为明显。Caspase8是细胞凋亡重要调节因子，是凋亡执行的重要效应分子，广泛表达于正常人体组织及多种肿瘤组织中。Caspase8基因变异可能扰乱Caspase8功能，进而影响细胞凋亡的执行，从而促进肿瘤的发生和发展。

报告基因是生物研究中的一种重要工具，常用作标记所要研究的目标基因，使得报告基因的表达水平与目标基因的表达水平相一致，从而可以通过对报告基因的表达来观察目标基因的表达调控。

基因编辑技术使我们能对特定目标基因进行敲入及敲除的“编辑”，通过利用CRISPR-Cas9基因编辑系统来构建Caspase8报告基因细胞系，对细胞凋亡及肿瘤的相关研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Caspase8报告基因细胞系的构建方法，其包括如下步骤：

(1)设计Caspase8基因上游位点特异性Caspase8-sgRNA序列并鉴定；

(2)利用步骤(1)中的序列构建pcDNA3.1/Hygro-Caspase8-sgRNA质粒；

(3)整合Caspase8基因的同源重组序列和报告基因片段，得到报告基因蛋白整合片段；

(4)将步骤(2)中上述质粒和步骤(3)中上述报告基因蛋白整合片段按1:1的比例共转染到肺癌细胞中；

(5)筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系，得到EGFP表达的细胞系；

(6)筛选得到的EGFP表达的细胞系并鉴定，得到Caspase8报告基因细胞系。

本发明的另一目的在于提供一种Caspase8报告基因细胞系，其通过上述Caspase8报告基因细胞系的构建方法构建而成。

本发明还有一目的在于提供一种上述Caspase8报告基因细胞系在下述(1)-(4)中任一的应用：

(1)在肿瘤细胞发生、发展及细胞凋亡研究中的应用；

(2)在细胞模型中的应用

(3)在研究Caspase相关基因中的应用；

(4)在药物筛选中的应用。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

第一方面，本发明实施例提供一种Caspase8报告基因细胞系的构建方法，其包括如下步骤：

(1)设计Caspase8基因上游位点特异性Caspase8-sgRNA序列及序列鉴定；

(2)通过CRISPR-Cas9技术，构建pcDNA3.1/Hygro-Caspase8-sgRNA质粒；