[发明专利]一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 202210119362.7 | 申请日： | 2022-02-08 |
| 公开（公告）号： | CN114480493A | 公开（公告）日： | 2022-05-13 |
| 发明（设计）人： | 左晖;吴文宝;郝花花;杨翔;陈立立;孔庆宏;沈悦海 | 申请（专利权）人： | 左晖;云南省第一人民医院 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/65;C12N5/10;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 成都鱼爪智云知识产权代理有限公司 51308 | 代理人： | 衡小璐 |
| 地址： | 650034 云南省*** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 caspase8 报告 基因 细胞系 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种Caspase8报告基因细胞系的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)设计Caspase8基因上游位点特异性Caspase8-sgRNA序列并鉴定；
(2)利用步骤(1)中的序列构建pcDNA3.1/Hygro-Caspase8-sgRNA质粒；
(3)整合Caspase8基因的同源重组序列和报告基因片段，得到报告基因蛋白整合片段；
(4)将步骤(2)中所述质粒和步骤(3)中所述报告基因蛋白整合片段按1:1的比例共转染到肺癌细胞中；
(5)筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系，得到EGFP表达的细胞系；
(6)筛选得到的EGFP表达的细胞系并鉴定，得到Caspase8报告基因细胞系。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述Caspase8-sgRNA的序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述绿色荧光蛋白整合片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，检测Caspase8表达量所用的引物组包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，检测Caspase8-DED表达量所用的引物组包括如SEQ ID NO.6所示的上游引物和SEQ ID NO.7所示的下游引物。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的构建方法，其特征在于，所述肺癌细胞为A549、NCI-H446、NCI-H460、NCI-H292、95-D或SPCA-1。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述报告基因为GFP、EGFP、Luciferase或RFP。
8.一种Caspase8报告基因细胞系，其特征在于，其通过如权利要求1所述的Caspase8报告基因细胞系的构建方法构建而成。
9.一种如权利要求2所述的Caspase8报告基因细胞系在下述(1)-(4)中任一的应用：
(1)在肿瘤细胞发生、发展及细胞凋亡研究中的应用；
(2)在细胞模型中的应用；
(3)在研究Caspase相关基因中的应用；
(4)在药物筛选中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞模型为肿瘤细胞模型；所述药物为靶向抗肿瘤细胞小分子药物、检测病毒载体毒性、筛选抗病毒药物以及大规模筛选调控载体转导毒性的小分子化合物。
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