[发明专利]一组A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一组A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用，属于病毒致弱技术领域。本发明提供了一组A型流感病毒致弱毒株，所述致弱毒株通过对M2基因进行修饰获得，所述修饰包括进行终止密码子突变和在突变的终止密码子后进行缺失突变。本发明所述致弱毒株稳定性更强，多次传代不会发生回复突变，安全性更高，对细胞系的依赖不强，在疫苗生产过程中具有较强的优势。

技术领域

本发明涉及病毒致弱技术领域，具体涉及一组A型流感病毒致弱毒株及 其制备方法和应用。

背景技术

A型流感病毒(Influenza A virus)是一类引起季节性流感的常见病毒种 类，是一种RNA病毒，易发生突变和重配。由于遗传漂变现象和病毒重配 导致每年引发流感的病毒都有可能不同，在人群中难以形成稳定的免疫，造 成反复发病。但是，由于缺乏针对流感的特效药物，最有效的方法仍是接种 流感疫苗。目前的流感疫苗有灭活疫苗和减毒活载体疫苗两类。减毒疫苗相 比灭活疫苗可以避免灭活过程中对抗原造成的损伤，同时也能刺激机体产生 更持久、更有效的免疫，如黏膜免疫、细胞免疫等，是相关疫苗研发的重要 方向。

当前市场上的流感减毒疫苗是温度敏感性减毒毒株，在25～33℃时可高 效复制，但在37～39℃时则复制受限。这类减毒疫苗则面临着保护力不稳定 的缺陷，有报道显示在不同年份提供的保护力差异从18～80％不等。因此， 急需开发新型的流感病毒减毒策略。

发明内容

本发明的目的在于提供一组A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应 用。本发明所述致弱毒株稳定性更强，多次传代不会发生回复突变，安全性 更高，对细胞系的依赖不强，在疫苗生产过程中具有较强的优势。

本发明提供了一组A型流感病毒致弱毒株，所述致弱毒株通过对M2基 因进行修饰获得，所述修饰包括进行终止密码子突变和在突变的终止密码子 后进行缺失突变。

优选的是，所述致弱毒株的背景毒株包括A/Puerto Rico/8/1934病毒。

优选的是，所述进行终止密码子突变为将M基因第761至第766位点 的核苷酸序列突变为两个终止密码子。

优选的是，所述缺失突变为在所述突变的终止密码子后分别缺失8～91 个核苷酸。

优选的是，所述缺失突变为在所述突变的终止密码子后分别缺失8、28、 73或91个核苷酸。

优选的是，对M2基因进行修饰后，M基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。

本发明还提供了上述技术方案所述致弱毒株的构建方法，包括以下步 骤：

构建含修饰后M2基因的质粒，获得缺陷型M2-2×stop+del质粒；

利用反向遗传系统，将表达流感病毒基因组片段和蛋白的质粒混合后转 染细胞，收获病毒，得到A型流感病毒致弱毒株；

所述质粒包括缺陷型M2-2×stop+del质粒、PB2质粒、PB1质粒、PA 质粒、NP质粒、NS质粒、HA质粒和NA片段的质粒；

所述质粒还包括表达PR8-M2蛋白的质粒。

优选的是，构建含修饰后M2基因的质粒所需的引物序列如SEQ ID NO.5～9所示。

优选的是，所述缺陷型M2-2×stop+del质粒分别含如SEQ ID NO.1～4 所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述技术方案所述致弱毒株或上述技术方案所述构建 方法构建得到的致弱毒株在制备流感减毒疫苗中的应用。