[发明专利]一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液、保存方法及应用

说明书

本发明公开了一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液、保存方法及应用，属于豹纹鳃棘鲈人工繁育领域。所述稀释液包括如下重量份的组分：氯化钠3.5份，碳酸氢钠1.68份，氯化钾2份，还原性谷胱甘肽2份，葡萄糖0.44份以及胎牛血清10份。将所述豹纹鳃棘鲈精液与所述稀释液按照稀释比例为1:9～1:99稀释后，于0～4℃保存。本发明首次确认并提出了豹纹鳃棘鲈精液0～4℃低温保存的新型配方，对精子无毒害作用，精子保存时间最长可达72h，保存24h时受精率和孵化率仍旧具有71.54％和61.84％，与鲜精相比，有效延长了精子保存时间，保证精子活率，可满足豹纹鳃棘鲈人工良种选育时精子低温短期储存的要求。

技术领域

本发明涉及豹纹鳃棘鲈人工繁育领域，特别是涉及一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液、保存方法及应用。

背景技术

鱼类生殖方式为体外受精，精子在精巢或精浆中是不活动的，一旦排入水中立即获能激活，进而开始运动，具有受精能力。豹纹鳃棘鲈俗称东星斑，是南方沿海重要的名贵海水养殖品种，许多养殖厂为了追求利润最大化，其养殖密度逐步升高，导致近亲繁殖程度加深，进一步使得种质退化和病害等问题显露。离体精子的有效保存手段可为人工授精甚至全人工繁育开创条件。在实际生产中，经常会遇到雌雄性腺发育不同步或雄鱼精液量不足等问题，那么就需要一种将精液短期储存数天甚至数十天的方法，除此之外，精子从亲鱼排出后，失去机体对营养物质的供应，所需能量仅来自精浆，便会很快就停止运动。因此在获取精子时应尽量避免受到污染，并置于低温(0～4℃)以减少精子能量消耗，添加合适的稀释液可减少精子黏稠性、维持内环境稳态、补充营养等，从而有效延长精子体外保存时间。合适的稀释倍数同样影响保存时间，当稀释倍数过小时，导致精液浓度过高、粘稠，从而活力变低；稀释倍数过大时，精子外部形态结构易发生变化，降低活力。

迄今为止，未见有豹纹鳃棘鲈精子低温(0～4℃)保存的报道或研究，仅见于中山大学蒙子宁团队关于“豹纹鳃棘鲈冷冻保存液及其保存方法”(专利号：ZL201410473950.6)，但其适用于冷冻保存且操作较为复杂，一般养殖场不会常备液氮和液氮罐，不同人员操作上存在差异，冻存精子解冻时间受主观影响大，会直接影响精子冷冻保存效果，即便有些精子解冻后具有活力，但其内外部生理生化功能受到冷冻损伤，而不具备受精能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液、保存方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该稀释液延长了低温保存时间，提高了受精率和孵化率，有效满足了豹纹鳃棘鲈人工良种选育时精子低温短期储存的要求。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种豹纹鳃棘鲈精液低温保存稀释液，包括如下重量份的组分：氯化钠3.5份，碳酸氢钠1.68份，氯化钾2份，还原性谷胱甘肽2份，葡萄糖0.44份以及胎牛血清10份。

该配方适合豹纹鳃棘鲈精液低温保存，包含了无机盐，用来保持pH、维持渗透压、抑制精子被激活，还添加了葡萄糖作为外部营养物质来源；还原性谷胱甘肽可降低精子呼吸代谢时产生的代谢产物导致的氧化损伤；胎牛血清(FBS)除了具有上述功能外，还能够减少精子在低温下产生的低温损伤。

本发明还提供所述的稀释液低温保存豹纹鳃棘鲈精液的方法，包括将所述豹纹鳃棘鲈精液与所述稀释液按照稀释比例为1:9～1:99稀释后，于0～4℃保存的步骤。

优选的是，还包括制备所述稀释液的步骤，具体为：

S1：按照各组分的用量称量氯化钠、碳酸氢钠、氯化钾、还原性谷胱甘肽、葡萄糖，常温溶解于超纯水，制备基础稀释液，4℃保存待用；

S2：将胎牛血清与所述基础稀释液按照体积比1:9混合，获得所述稀释液。

优选的是，所述超纯水在120℃高温灭菌30min。

优选的是，所述基础稀释液4℃保存不超过7天。