[发明专利]萤火虫发光科普教育试剂盒、荧光素酶及其制备方法

说明书

本发明提供了一种荧光素酶，来源于雷氏萤，具有在不同pH条件下发光波长变化的蛋白特性，酸性条件下为橙黄色光，碱性条件下为明黄色光，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.1；将荧光素酶应用于萤火虫发光科普教育试剂盒中，可以实现普通公众通过自己操作提取萤火虫体内发光底物(荧光素)，并进行萤火虫发光的实验，了解萤火虫发光的原理。

技术领域

本发明涉及萤火虫发光技术领域，尤其涉及萤火虫发光科普教育试剂盒、荧光素酶及其制备方法。

背景技术

萤火虫因为其发光的特性，已经成为环境保护的指示生物和明星物种，被列入三有保护名录，随着现在萤火虫旅游的热度逐渐上升，以及萤火虫保护地增多，公众逐渐认识到保护萤火虫的重要性，对于接触萤火虫，并进行相关科普教育的需求也越来越多。但目前主流的科普方式均采用的萤火虫标本展示形式，是一种枯燥的形态展示，缺乏互动性和直观性，无法更好地展示萤火虫最重要的特征。此外，公众对于萤火虫最为好奇的是其发光，而大家对于萤火虫的发光原理知之甚少。

萤火虫有专门的发光细胞，在发光细胞中有两类物质，一类被称作荧光素，另一类被称为荧光素酶。荧光素作为反应底物能在荧光素酶的催化下通过消耗ATP和氧气，产生激发态的氧化荧光素，当氧化荧光素从激发态回到基态时释放出光子，从而发光。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种萤火虫发光科普教育试剂盒、荧光素酶及其制备方法，可以实现普通公众通过自己操作提取萤火虫体内发光底物(荧光素)，并进行萤火虫发光的实验，了解萤火虫发光的原理。

本发明是这样实现的：

本发明提供一种荧光素酶，来源于雷氏萤，具有在不同pH条件下发光波长变化的蛋白特性，酸性条件下为橙黄色光，碱性条件下为明黄色光，其氨基酸序列为：SEQ IDNO.1。

进一步地，荧光素酶的获取方法为：将雷氏萤luc1基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞制成重组菌株，利用该重组表达载体在大肠杆菌宿主细胞中表达荧光素酶的蛋白。

进一步地，重组表达载体和重组菌株合成的具体步骤为：

设计一对引物，以雷氏萤cDNA为模版，进行PCR扩增，将PCR扩增产物回收后，以EcoRI/XhoI进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pET32a进行连接构建重组表达载体pET32a-luc1，pET32a-luc1转化大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，制备重组菌株Rosetta-pET32a-luc1。

进一步地，引物为：

P1677F：5′-GGAATTCATGGAAAACATGGATAATGATG-3′；

P1677R：5′-CCGCTCGAGCATCTTTGCATTTGGTTTCTTG-3′。

本发明还提供该荧光素酶的制备方法，包括以下步骤：

S1、选取Rosetta-pET32a-luc1菌株，按一定比例接入含抗生素的LB培养基，培养获得种子液；

S2、种子液转接培养后，加入IPTG诱导培养；

S3、离心收菌，去除上清，沥干，置于－20℃暂存或直接进行纯化；

S4、收集大量表达的菌体，加入20％Triton X-100和PMSF后混匀，用离心管分装菌液进行超声破碎，直至菌液澄清半透明状态；破碎的菌液离心后收集上清；

S5、沉淀蛋白，离心后收集沉淀，溶解沉淀，测定蛋白浓度至蛋白终浓度。

进一步地，步骤S1中接种比例为1/100-1/200，步骤S5中蛋白终浓度为1mg/ml。