[发明专利]萤火虫发光科普教育试剂盒、荧光素酶及其制备方法

权利要求书

1.一种荧光素酶，其特征在于，来源于雷氏萤，具有在不同pH条件下发光波长变化的蛋白特性，酸性条件下为橙黄色光，碱性条件下为明黄色光，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的荧光素酶，其特征在于，其获取方法为：将雷氏萤luc1基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞制成重组菌株，利用该重组表达载体在大肠杆菌宿主细胞中表达荧光素酶的蛋白。

3.如权利要求2所述的荧光素酶，其特征在于，重组表达载体和重组菌株合成的具体步骤为：

设计一对引物，以雷氏萤cDNA为模版，进行PCR扩增，将PCR扩增产物回收后，以EcoRI/XhoI进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pET32a进行连接构建重组表达载体pET32a-luc1，pET32a-luc1转化大肠杆菌感受态细胞E.coli Rosetta(DE3)，制备重组菌株Rosetta-pET32a-luc1。

4.如权利要求3所述的荧光素酶，其特征在于，引物为：

P1677F：5′-GGAATTCATGGAAAACATGGATAATGATG-3′；

P1677R：5′-CCGCTCGAGCATCTTTGCATTTGGTTTCTTG-3′。

5.权利要求1-4所述荧光素酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、选取Rosetta-pET32a-luc1菌株，按一定比例接入含抗生素的LB培养基，培养获得种子液；

S2、种子液转接培养后，加入IPTG诱导培养；

S3、离心收菌，去除上清，沥干，置于－20℃暂存或直接进行纯化；

S4、收集大量表达的菌体，加入适量PBS，20％Triton X-100和PMSF后混匀，用离心管分装菌液进行超声破碎，直至菌液澄清半透明状态；破碎的菌液离心后收集上清；

S5、使用硫酸铵沉淀方法纯化蛋白，离心后收集沉淀，溶解沉淀，测定蛋白浓度，并稀释到工作液所需蛋白终浓度。

6.如权利要求5所述的荧光素酶的制备方法，其特征在于：步骤S1中接种比例为1/100-1/200，步骤S5中硫酸铵纯化浓度为35％，蛋白终浓度为1mg/ml。

7.一种萤火虫发光科普教育试剂盒，该试剂盒的试剂中含有权利要求1-4所述的荧光素酶，其特征在于，包括盒体，盒体右侧设有置物孔，上方开设观察窗，置物孔和观察窗形成一个观察仓；盒体内装有萤火虫观察研磨管、研磨棒、反应管、过滤管、巴氏吸管、乳胶手套和试剂，试剂还包括D-luciferin提取缓冲液，发光反应液和变色缓冲液。

8.如权利要求7所述的萤火虫发光科普教育试剂盒，其特征在于：所述萤火虫观察研磨管内含有若干只冻干萤火虫，冻干萤火虫收集于饲养基地中已经产卵后死去的完整萤火虫，并进行冻干处理。

9.如权利要求7所述的萤火虫发光科普教育试剂盒，其特征在于：D-luciferin提取缓冲液用于提取冻干萤火虫中的荧光素，为pH6.4的PBS溶液；发光反应液包含ATP、MgCl₂；变色缓冲液为Tris溶液。

10.权利要求7-9任一所述萤火虫发光科普教育试剂盒的使用方法，其特征在于，包括下列步骤：

S1、带上乳胶手套，取出试剂盒中试剂；

S2、吸取提取缓冲液，加入到萤火虫观察研磨管中，用研磨棒在管中搅动研磨萤火虫冻干虫体，至全部研磨破碎；

S3、向反应管内放入过滤管，吸取萤火虫观察研磨管中的液体加入到反应管中，液体过滤后丢掉过滤管，盖上反应管的盖子，反复摇晃反应管30s，在观察仓内观察发光情况；

S4、打开反应管的盖子，吸取发光反应液，加入到反应管中，盖上反应管的盖子，反复摇晃反应管30s，在观察仓内观察发光情况；

S5、打开反应管的盖子，吸取荧光素酶，加入到反应管中，盖上反应管的盖子，反复摇晃反应管30s，在观察仓内观察发光情况；

S6、打开反应管的盖子，吸取变色缓冲液，加入到反应管中，盖上反应管的盖子，反复摇晃反应管30s，在观察仓内观察发光情况；

S7、清理实验台面，扔掉垃圾。