[发明专利]一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法

说明书

本发明公开了一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法，属于生物医药技术领域。本发明将蛋白质‑高分子偶联物与生物分析结合在一起，成功地开发出用于蛋白质定量分析的方法。在以二氧化硅微球作为固相载体材料的基础上，预先包被目标分析抗原蛋白分子，利用抗原抗体的特异性识别反应，将事先接枝了光引发剂的抗体IgG‑I大分子间接地固定在微球表面，构建出“竞争”免疫检测方法。该方法是一种快速、简便、廉价、无酶的级联放大检测技术，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法。

背景技术

蛋白药物相比其他药物具有多种优势，如特异性强、相容性好。尽管如此，蛋白质或者多肽类药物仍然存在些许局限性，如细胞摄取低、生物利用率低、容易受到环境干扰、易失活等，这些局限性正阻碍着蛋白质药物的开发与利用。

蛋白质在人体内的各项生理活动中发挥着至关重要的作用，对蛋白质分子的灵敏特异性检测在分子诊断学研究和生物医药领域具有重要意义。为了提高蛋白质检测方法的灵敏度、降低检测限，开发一种合适的信号放大方法是十分必要的。近年来，高分子偶联蛋白质的技术发展日新月异，通过偶联高分子可以赋予蛋白质新的功能与性质，在药物传输、医疗诊断等多个领域展现了广阔的应用前景。其中，多个高分子重复单元的聚集，可以起到信号放大的作用，在生物分析中具有潜在的应用价值。本发明发展一种新型的蛋白质-高分子偶联物合成方法，并在此基础上开发出一种便捷的、快速的信号放大方法以应用于蛋白质的免疫分析。

牛血清白蛋白（BSA）是一种球状蛋白，因其具备价格低、易获得性且与人血清白蛋白（HSA）的高度结构同源性等优点，在各种生化分析中被公认为是最受欢迎的模板。同样，BSA在与人类相关的各种疾病的病理学（如糖尿病、疯牛病、肾病等）中也存在着极其重要的意义。因此，本发明开发出了一种能够快速、精准地检测BSA的方法。

发明内容

本发明的目的针对现有技术中蛋白质分子检测灵敏度低的问题，于提供一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法，实现基于Photo ATRP技术的信号放大策略在生物分析中的应用，发展出一种快速、简便、廉价、无酶的级联放大检测技术。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法，包括以下步骤：

（1）二氧化硅微球的表面修饰：利用APTMS和戊二醛对二氧化硅微球表面进行化学修饰，获得醛基-氨基-功能化二氧化硅微球溶液；

（2）负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球的制备：利用抗原蛋白分子的氨基与醛基-氨基-功能化二氧化硅微球表面的醛基进行醛胺缩合形成希夫碱，从而以共价交联的形式将抗原蛋白分子固定在二氧化硅微球表面的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球；

（3）封闭二氧化硅微球表面的非特异性结合位点；使用封闭剂封闭微球表面的非特异性结合位点；

（4）抗体IgG-光引发剂大分子的制备：利用高碘酸钠的强氧化性打开抗体IgG糖基化位点的六元环，形成醛基，随后将光引发剂与醛基进行定点的肟化反应，合成抗体IgG-光引发剂大分子；

（5）光介导ATRP反应竞争免疫检测抗原蛋白分子含量：将抗原蛋白分子样品溶液、封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液和抗体IgG -光引发剂大分子溶液加入聚合溶液中；在催化剂的作用下，抗体IgG -光引发剂大分子与聚合溶液中的配体、信号分子单体通过Photo ATRP反应共聚形成带有光引发剂标签的抗体IgG -高分子偶联物；利用抗原抗体之间的特异性识别能力，样品中待检测的抗原蛋白分子与固定在二氧化硅微球表面的抗原蛋白分子共同竞争带有光引发剂标签的抗体IgG -高分子偶联物，间接地将抗体IgG -高分子偶联物固定在二氧化硅微球表面，通过荧光强度变化检测抗原蛋白分子含量。

进一步的，上述方法中所述抗原蛋白分子包括但不限于牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA。