[发明专利]一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法

权利要求书

1.一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）二氧化硅微球的表面修饰：利用APTMS和戊二醛对二氧化硅微球表面进行化学修饰，获得醛基-氨基-功能化二氧化硅微球溶液；

（2）负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球的制备：利用抗原蛋白分子的氨基与醛基-氨基-功能化二氧化硅微球表面的醛基进行醛胺缩合形成希夫碱，从而以共价交联的形式将抗原蛋白分子固定在二氧化硅微球表面的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球；

（3）封闭二氧化硅微球表面的非特异性结合位点；使用封闭剂封闭微球表面的非特异性结合位点；

（4）抗体IgG-光引发剂大分子的制备：利用高碘酸钠的强氧化性打开抗体IgG糖基化位点的六元环，形成醛基，随后将光引发剂与醛基进行定点的肟化反应，合成抗体IgG-光引发剂大分子；

（5）光介导ATRP反应竞争免疫检测抗原蛋白分子含量：将抗原蛋白分子样品溶液、封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液和抗体IgG -光引发剂大分子溶液加入聚合溶液中；在催化剂的作用下，抗体IgG -光引发剂大分子与聚合溶液中的配体、信号分子单体通过Photo ATRP反应共聚形成带有光引发剂标签的抗体IgG -高分子偶联物；利用抗原抗体之间的特异性识别能力，样品中待检测的抗原蛋白分子与固定在二氧化硅微球表面的抗原蛋白分子共同竞争带有光引发剂标签的抗体IgG -高分子偶联物，间接地将抗体IgG -高分子偶联物固定在二氧化硅微球表面，通过荧光强度变化检测抗原蛋白分子含量。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（1）二氧化硅微球的表面修饰，具体包括以下步骤:

1) 二氧化硅微球的表面修饰：将按照二氧化硅微球与3-氨丙基三甲氧基硅烷1:10的摩尔比例将1mg/ml的二氧化硅微球悬浮液与3-氨丙基三甲氧基硅烷混合，混合物在4℃下连续搅拌18 h，离心收集沉淀，用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，再用超纯水分散，获得氨基功能化的二氧化硅微球溶液备用；

2）将2.5wt%戊二醛溶液加入氨基功能化的二氧化硅微球溶液中，室温快速搅拌反应2h，反应结束后，将得到的醛基-氨基-功能化二氧化硅微球混合物离心得到沉淀，用超纯水洗涤三次，并在PBS中重新分散获得醛基-氨基-功能化二氧化硅微球溶液。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（2）负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球的制备，具体包括：将醛基-氨基-功能化二氧化硅微球溶液与抗原蛋白分子溶液混合，4℃搅拌24 h，洗涤离心收集沉淀并分散于PBS溶液中，获得负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（3）封闭二氧化硅微球表面的非特异性结合位点，具体包括：取制备好的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球，加入经PBS溶液按 1:20体积比稀释的血清，混匀并置于37℃混匀连续搅拌反应2 h，以封闭二氧化硅微球表面未被结合的非特异性位点；PBST缓冲液洗涤三次，离心收集沉淀并分散于PBS溶液中，获得封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（4）抗体IgG-光引发剂大分子的制备，具体包括以下步骤：

1）IgG的氧化：将高碘酸钠溶液加入浓度为1 mg/mL的IgG溶液中，快速混匀，放置在碎冰上避光反应30 min；利用高碘酸钠的强氧化性打开BSA抗体IgG糖基化位点的六元环形成醛基；氧化反应完成后，将亚焦硫酸钠溶液加入氧化反应溶液中，终止反应5 min，反应完成后，置于PBS缓冲液中，4℃搅拌透析24 h，获得IgG氧化反应溶液；其中IgG：高碘酸钠：亚焦硫酸钠的摩尔比为1：10：10；

2）IgG -光引发剂大分子的合成：在步骤1）IgG-I氧化反应溶液中加入光引发剂2-氨氧基-3-溴-2-甲基丁酸酯溶液，快速混匀后将混合溶液放置在37℃的水浴锅中光引发剂与醛基进行定点的肟化反应反应1h，反应完成后，置于PBS缓冲液中，4℃搅拌透析24 h，获得IgG-光引发剂大分子溶液；其中IgG：光引发剂的摩尔比为1：200。