[发明专利]一种提高冷冻卵母细胞体外培育质量的培养液及其应用

说明书

本发明涉及一种提高冷冻卵母细胞体外培育质量的培养液及其应用。本发明提出的一种提高冷冻卵母细胞体外培育质量的培养液，在M16培养液中添加伴刀豆球蛋白A，通过调节皮质张力恢复冷冻卵母细胞机械特性从而提高冷冻卵母细胞体外培育质量。本发明首次提出通过调节皮质张力恢复冷冻卵母细胞机械特性从而提高冷冻卵母细胞体外培育质量的技术路线，明确了通过调节皮质张力可以恢复冷冻卵母细胞机械特性，增强纺锤体组装检验点活性，降低非整倍体比例，进而提高冷冻卵母细胞体外培育的内在质量。本发同时给出ConA在M16培养液中的添加浓度为1‑100μg/ml，优选10μg/ml。

技术领域

本发明涉及繁殖技术领域，具体涉及一种提高冷冻卵母细胞体外培育质量的培养液及其应用。

技术背景

卵母细胞冷冻技术是重要的生殖生物学技术，广泛应用于种质资源保存、生育力保存及辅助生殖技术中，但解冻后卵母细胞存在发育潜能下降等问题，有报道称至少冷冻20枚成熟卵母细胞方可获得出生后代，严重制约了此项技术的广泛应用，因此，提高冷冻卵母细胞利用效率是亟待解决的问题，对解冻损伤机制的深入解析是提高冷冻卵母细胞有效利用的前提。

卵母细胞发育经历了由GV、GVBD(卵母细胞开始体外成熟后2.5h)至MII期(卵母细胞开始体外成熟后12h)的减数分裂过程，我们前期研究发现冷冻GV期卵母细胞体外成熟后非整倍体比例显著升高，动粒-微管(kinetochore-microtubule,KT-MT)错误连接可造成染色体不正确分离。皮质位于质膜下，在维持细胞形状及机械特性方面发挥重要作用。玻璃化冷冻中，卵母细胞在脱水-再水化过程中其体积也经历了缩水-膨胀的形态学改变，其剧烈的体积变化势必引起细胞机械力学的变化，研究也指出冷冻对卵母细胞细胞骨架及线粒体功能损伤最大，但目前皮质机械力学改变对冷冻卵母细胞质量的影响尚未见报道。

皮质张力是皮质细胞骨架收缩性的高度敏感读数，反映了皮质的生化和结构特征。卵母细胞皮质张力主要由ERM家族蛋白、myosin-II、actin介导产生。Ezrin/Radixin/Moesin(ERM)家族及非肌肉肌球蛋白II是两类调节卵母细胞皮质张力的重要蛋白，通过调控机械特性参与细胞极性建立，促进减数分裂进程。磷酸化的ERM(phosphor-ERMs，pERM)是ERM的活性形式，而磷酸化的肌球蛋白调节轻链蛋白(phosphorylation of myosinregulatory light chain，pMRLC)可调节肌球蛋白II活性，其中，pERM水平与皮质张力正相关，pMRLC在胞质中的分布水平与皮质张力呈负相关。卵母细胞发育过程中皮质区域的重塑和机械性能的变化对减数分裂的完成以及受精、胚胎发育具有重要意义。

目前，市场上现有冷冻、解冻试剂普遍为渗透性及非渗透性冷冻保护剂，通过置换卵母细胞内水分，防止冷冻解冻过程中冰晶形成以达到保护卵母细胞的目的，没有针对调节皮质张力改善冷冻卵母细胞质量的冻存体系。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提出一种提高冷冻卵母细胞体外培育质量的培养液及其应用。

本发明提出的一种提高冷冻卵母细胞体外培育质量的培养液，在M16培养液中添加伴刀豆球蛋白A，通过调节皮质张力恢复冷冻卵母细胞机械特性从而提高冷冻卵母细胞体外培育质量。

进一步，所述刀豆球蛋白A的添加浓度为1-100μg/ml。

进一步，所述刀豆球蛋白A的添加浓度为10μg/ml。

本发明同时提出一种提高冷冻卵母细胞体外培育质量的方法，包括如下步骤：

S1、采集GV期卵母细胞并置于M2液滴中备用；

S2、将卵母细胞转移至平衡液中30秒，随后转移至玻璃化冷冻液中20-30秒，然后迅速将卵母细胞置于载杆前端，投入液氮；

S3、解冻时，将S2所述载杆迅速从液氮中取出，置于含0.5M蔗糖的PBS中作用5min，然后用M2液清洗三遍后备用；