[发明专利]一种人源超氧化物歧化酶hSOD1突变体的制备及其应用

说明书

本发明提供一种人源超氧化物岐化酶hSOD1突变体制备方法及其应用，涉及生物工程技术领域。提供一种人源超氧化物歧化酶hSOD1突变体的编码蛋白，其具有SEQIDNO.Mt1SOD1aa所示氨基酸序列；提供一种编码上述蛋白的Mt1SOD1基因，具有SEQIDNO.Mt1SOD1所示核苷酸序列。本发明以人源hSOD1为模板，通过基因突变获得了hSOD1突变体Mt1SOD1(E25G、P29T、E101V、C112S)基因，重组人源超氧化物歧化酶hSOD1突变体Mt1SOD1蛋白；在应用上解决了异源性问题。且具备高活性高稳定性，对新型功能型抗衰妆品及系列产品的开发、其他抗衰产品如功能食品、抗衰药品的开发提供了新的途径。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人源超氧化物歧化酶hSOD1突变体的制备及其应用。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是一种普遍存在于各类生物体中的活性物质，是生物体内最核心的自由基清除酶，能够专一地清除机体内细胞代谢过程中超氧阴离子，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线。SOD可减少由光照黑色素耗氧过多而产生的氧自由基，防止过多的黑色素形成，同时也可不断地清除由脂褐素和蜡样质产生的氧自由基，避免过多的脂质发生过氧化，减少脂褐素和蜡样质的形成。此外机体中SOD的活性升高可减轻组织细胞过氧化性损伤，降低脂类过氧化物的形成，加强分解体内过多的脂质过氧化物。SOD不仅具有延缓皮肤衰老的功能，还在机体氧化应激、抗炎修复、抗皱等方面起重要作用，现已被广泛运用于医疗、食品以及化妆品行业。

目前重组SOD1已成功在大肠杆菌、毕赤酵母、乳酸菌、聚球藻、山羊乳腺细胞等表达系统中表达，然而，到目前为止，这些系统还没有能够大规模生产出产量和活性都令人满意的重组Cu/Zn-SOD(SOD1)。牦牛属于牛属牦牛亚属牦牛种，青藏高原高寒缺氧的恶劣环境使其体内的SOD活性随含氧量的降低而升高，从牦牛血中提取的牦牛SOD1活性高达13000U。例如发明专利201010169323.5号重组表达牦牛SOD1的文献，但仍然是传统的动物提取出来的SOD，存在稳定性较差，表达水平不稳定，活性难以保持等缺陷。基于目前现有技术中重组Cu/Zn-SOD(SOD1)存在的缺陷，本研究以hSOD1为模板，利用生物信息学结合分子生物学方法对比牦牛SOD1基因序列，得到hSOD1突变体，重组出来的突变体也是人源的，在应用上解决了异源性问题。

本发明通过对人源hSOD1进行氨基酸位点优化，利用大肠杆菌表达系统，优化发酵及纯化条件，获得高活性高稳定性的重组人源hSOD1突变体。此重组人源hSOD1突变体可应用于新型功能型抗衰妆品，且可用于系列产品的应用开发以及其他抗衰品(如功能食品、抗衰药品)的开发应用。

发明内容

本发明提供一种人源hSOD1突变体的制备方法及其应用。公开了人源超氧化物歧化酶hSOD1突变体的编码蛋白，其具有SEQ ID NO.Mt1SOD1 aa所示的氨基酸序列；

本发明以hSOD1为模板，利用生物信息学结合分子生物学方法对比牦牛SOD1基因序列，得到人源超氧化物歧化酶hSOD1突变体Mt1SOD1(E25G、P29T、E101V、C112S)基因，命名为Mt1SOD1。

本发明公开了一种编码上述蛋白的Mt1SOD1基因，具有SEQ ID NO.Mt1SOD1所示的核苷酸序列。

本发明还公开了一种含有上述基因的pET-28a(+)-Mt1SOD1表达载体以及含有所述载体的BL21(DE3)-pET28a(+)-Mt1SOD1工程菌。

一种重组人源超氧化物歧化酶hSOD1突变体Mt1SOD1的制备方法，步骤如下：

(1)NCBI获取序列，进行密码子优化，5‘端添加6×His-tag标签，化学合成5‘端具有6×His-tag编码序列的hSOD1、Mt1SOD1基因，化学合成由擎科公司代理完成；