[发明专利]一种增强同源重组能力的酵母基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种增强同源重组能力的酵母基因工程菌及其应用，涉及生物工程领域。所述酵母基因工程菌，以酵母作为出发菌株，通过导入基因构建获得所述酵母基因工程菌，导入基因包括以下任意一组：(1)RAD52基因、RAD59基因和MRE11基因；(2)RAD52基因和RAD59基因；(3)RAD52基因和MRE11基因；(4)RAD52基因和SAE2基因；(5)RAD52基因；(6)RAD52基因、RAD59基因、MRE11基因和SAE2基因。本发明的酵母基因工程菌能够实现具有约40bp同源臂的异源基因表达盒的单、二和三基因同时整合，效率分别高达100％、约98％和约81％。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种增强同源重组能力的酵母基因工程菌及其应用。

背景技术

毕赤酵母(Pichia pastoris)能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长，具有蛋白高表达的特性，不仅拥有真核生物中最强的甲醇诱导型启动子pAOX1，还可以进行高密度发酵，利于工业规模化生产，被认为是最具发展前景的生产蛋白质的宿主之一。建立甲基营养酵母毕赤酵母作为生产燃料、化学品和天然产品的微生物细胞工厂受到越来越多的关注，特别是以甲醇为原料。

考虑到游离质粒的稳定性和代谢负担问题，通常采用基因组整合来高效表达外源基因。虽然在毕赤酵母中已经建立了CRISPR基因编辑技术，并用于多基因生物合成途径的整合，但仅限于少数的几个例子，且通常需要较长的同源臂(500-1000bp)，同源臂通常是指打靶载体上待插入的外源序列两侧的与基因组序列完全一致的侧翼序列，用于识别并发生重组的区域。巴斯德毕赤酵母中的同源重组效率较低，通常需要较长的同源片段，随着同源臂长度的降低，编辑效率也会显著下降。因此，利用较短的单链寡核苷酸片段在酵母中实现高效的基因编辑成为研究热点。尽管在一些微生物中已能利用寡核苷酸介导的基因重组对基因组进行定点突变，但在酵母中的低重组效率限制其在酵母基因组进化中的应用。因此，亟需通过基因工程手段进行改造和提升。

破坏非同源端连接(non-homologous end joining，NHEJ)相关基因(即KU70基因)已被发现是提高同源重组效率的有效策略，可以显著的提高同源重组的效率，在长同源臂的情况下(1000bp)，三位点同时整合的效率可达到12.5％-32％(Liu,Q.,Shi,X.,Song,L.,Liu,H.,Zhou,X.,Wang,Q.,Zhang,Y.,and Cai,M.CRISPR-Cas9-mediated genomicmultiloci integration in Pichia pastoris.Microbial Cell Factories,2019,18,144.doi:10.1186/s12934-019-1194-x)。但KU70基因敲除菌株的转化子会大大减少，且存在染色体末端大片段丢失的可能(Ito,Y.,Watanabe,T.,Aikawa,S.,Nishi,T.,Nishiyama,T.,Nakamura,Y.,Hasunuma,T.,Okubo,Y.,Ishii，J.,and Kondo,A.Deletion of DNAligase IV homolog confers higher gene targeting efficiency on homologousrecombination in Komagataella phaffii.FEMS Yeast Research,2018,18.doi:10.1093/femsyr/foy074)。在不干扰NHEJ的情况下提高同源重组效率是构建毕氏酵母细胞工厂的迫切要求。

发明内容

为了在毕赤酵母中实现具有短同源臂的异源基因的高效基因组整合，我们旨在通过引入酿酒酵母的重组机制来提高其同源重组效率。本发明过表达了酿酒酵母的的HR相关基因，包括RAD52基因、RAD59基因、MRE11基因和SAE2基因，并评估它们对基因组整合效率的影响。同时构建了HR相关基因效率增强型毕赤酵母。