[发明专利]一种鸭小肠隐窝干细胞分离鉴定和3D类器官培养的方法

说明书

本发明属于动物组织分离和培养技术领域。具体涉及一种鸭小肠隐窝干细胞分离和3D类器官培养的方法。本发明首次在鸭肠道领域提出3D类器官培养，并通过调整消化液的配比与浓度、水平摇床低温消化的时间与次数，优化鸭小肠隐窝干细胞的分离技术，使获得的鸭小肠隐窝干细胞形态更加完整，存活率与出芽率更高。本发明优化了用于培养鸭小肠隐窝干细胞的培养基的配方，使鸭小肠隐窝干细胞能更好的分化形成3D类器官。本发明确定了鸭小肠隐窝干细胞的分离条件与最佳培养方法，为后续利用鸭小肠3D类器官研究肠道隐窝干细胞功能奠定了良好的基础。

技术领域

本发明属于动物组织分离和培养技术领域。具体涉及一种鸭小肠隐窝干细胞分离和3D类器官培养的方法。

背景技术

随着人类对生命科学研究的不断深入，模型系统已经成为相关研究的重要工具。传统用于肠道生理病理研究的模型是由某单一种类细胞构成的，而肠道各部分具有独特生理功能与组织结构，传统单细胞模型无法做到真实模拟肠道的结构、形态及功能的作用，严重限制了肠道健康功能调控的研究。近年来，肠道3D类器官的发展为肠道健康研究提供了一个新的模型。类器官(organoids)来源于干细胞或器官祖细胞，是利用干细胞增殖分化的特性进行体外3D培养后形成的细胞团。类器官与来源器官的关系紧密，具有来源器官的三维细胞结构，可重现来源器官的部分功能与空间构架，可真实的反应肠道内的生理和病理过程。

目前人和小鼠的肠道3D类器官模型的研究已经比较成熟，人们能够在体外稳定传代培养人和小鼠的肠道3D类器官，且能长期冻存和复苏，已被广泛应用。

肠道是机体消化吸收营养物质的主要器官，也是防止肠道微生物侵袭的先天屏障，肠道健康对机体至关重要。鸭肠道损伤会导致生产力下降、抗病力差甚至死亡，给养殖户带来严重的经济损失，目前人们主要利用传统的2D单细胞培养来进行鸭肠道损伤的相关研究，但由于2D培养的种种缺点，很难真实的反映鸭肠道内的生理与病理情况。类器官培养是一种新型的3D模型，可真实反映肠道内的病理与生理情况，但目前有关鸭肠道类器官培养的相关文章却鲜见报道。

发明内容

本发明的目的在于建立稳定的鸭小肠隐窝干细胞的分离鉴定方法和鸭小肠3D类器官模型培养方法。本发明通过参考小鼠、猪、鸡等动物的肠道隐窝干细胞分离和3D类器官培养方法，建立了稳定的鸭小肠隐窝干细胞分离和3D类器官培养技术。

为达到上述技术目的，本发明具体技术方案如下：

首先，本发明提供一种鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，包括以下步骤：

(1)在无菌条件下分离啄壳鸭胚小肠，洗涤后剥离肠系膜，纵向将肠道剖开，剪成小块后用冰DPBS缓冲液冲洗干净；

(2)转移至消化液中4℃摇晃消化15min；

(3)离心沉淀换新的消化液4℃摇晃消化45min；

(4)DPBS清洗一遍，再加入冰DPBS轻柔吹打肠段，将悬液转移至新的离心管中，即为隐窝悬液。

具体的，所述步骤(2)和(3)中消化液为含2.5mmol/L EGTA和0.5％葡萄糖的冰DPBS缓冲液。

具体的，所述步骤(2)和(3)中摇晃的条件为摇床转数100r/min。

具体的，所述步骤(4)中冰DPBS清洗和冰DPBS轻柔吹打肠段的步骤重复4～5次，最终收集的悬液即为隐窝悬液。

其次，本发明提供一种鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法，包括以下步骤：

(a)将上述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法得到的隐窝悬液离心后弃上清，冰PBS缓冲液重悬后铺于24孔板中，吸弃PBS，用4％多聚甲醛溶液固定；

(b)吸弃多聚甲醛，用DPBS洗涤隐窝干细胞3次，每次3min；