[发明专利]一种鸭小肠隐窝干细胞分离鉴定和3D类器官培养的方法

权利要求书

1.一种鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在无菌条件下分离啄壳鸭胚小肠，洗涤后剥离肠系膜，纵向将肠道剖开，剪成小块后用冰DPBS缓冲液冲洗干净；

(2)转移至消化液中4℃摇晃消化15min；

(3)离心沉淀换新的消化液4℃摇晃消化45min；

(4)DPBS清洗一遍，再加入冰DPBS轻柔吹打肠段，将悬液转移至新的离心管中，即为隐窝悬液。

2.根据权利要求1所述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中消化液为含2.5mmol/L EGTA和0.5％葡萄糖的冰DPBS缓冲液。

3.根据权利要求1所述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中摇晃的条件为摇床转数100r/min。

4.根据权利要求1所述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，所述步骤(4)中冰DPBS清洗和冰DPBS轻柔吹打肠段的步骤重复4～5次，最终收集的悬液即为隐窝悬液。

5.一种鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将由权利要求1所述的方法得到的隐窝悬液离心后弃上清，冰PBS缓冲液重悬后铺于24孔板中，吸弃PBS，用4％多聚甲醛溶液固定；

(b)吸弃多聚甲醛，用DPBS洗涤隐窝干细胞3次，每次3min；

(c)吸弃DPBS，加入适量胎牛血清封闭30min；

(d)吸弃胎牛血清，加入稀释好的Lgr5一抗37℃封闭2小时，用PBS洗涤3次，每次3min；

(e)加入稀释好的FITC二抗，避光封闭30min，用PBS洗涤3次，每次3min；

(f)利用Dapi试剂对细胞核进行染色，时间为5-8min，用PBS洗涤3次，每次3min；

(g)利用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行染色，时间为30min，用PBS洗涤3次，每次3min；

(h)染色完成后利用荧光显微镜对染色结果进行拍照记录。

6.权利要求5中鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法在鸭小肠类器官相关研究中的应用。

7.一种鸭小肠3D类器官培养的方法，其特征在于，制备类器官生长培养基和类器官分化培养基，将由权利要求1所述的方法得到的隐窝悬液计数后，去上清重悬隐窝干细胞铺于24孔板中，依次加入类器官生长培养基和更换类器官分化培养基，隐窝干细胞培养四天后进行传代。

8.根据权利要求7所述鸭小肠3D类器官培养的方法，其特征在于，所述类器官生长培养基，其配方为：Wnt3a 40μl；R-spondin1 40μl；Noggin 40μl；B27 supplement 800μl；N2supplement 400μl；n-Acetyl Cysteine 80μl；EGF 40μl；SB202190 40μl；Y27632 40μl；Nicotinamide 400μl；GastrinⅠ20μl；A83-01 80μl；DMEM-F12 37.98ml，共40ml；所用的类器官分化培养基，其配方为：B27 supplement 800μl；R-spondin1 40μl；Noggin 40μl；N2supplement 400μl；n-Acetyl Cysteine 80μl；EGF 40μl；Y27632 40μl；GastrinⅠ20μl；A83-01 80μl；LY2157299 40μl；Primocin 80μl；DAPT 40μl；DMEM-F12 37.98ml，共40ml；培养条件为于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。