[发明专利]融合酶的制备方法及融合酶

权利要求书

1.一种融合酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：

构建融合酶质粒；

提取融合酶质粒，并将其转入到毕赤酵母中，进行发酵表达；

利用毕赤酵母制备粗酶液，并进行融合酶的分离纯化。

2.根据权利要求1所述的融合酶的制备方法，其特征在于，所述构建融合酶质粒包括以下步骤：

a1.构建6×His-SUMO-JaWa、6×His-SUMO-SoLo、6×His-SUMO-WamPa的融合表达基因；

a2.利用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ将融合酶基因序列连接到E.coli DH5α载体上，构建出重组质粒。

3.根据权利要求1所述的融合酶的制备方法，其特征在于，所述提取融合酶质粒为从大肠杆菌中提取，并包括以下步骤：

b1.将融合酶质粒从大肠杆菌中提取出来；

b2.用Sal I内切酶将环形质粒切开；

b3.利用DNA电泳判断线性化质粒的条带位置；

b4.将线性化质粒进行纯化浓缩。

4.根据权利要求1所述的融合酶的制备方法，其特征在于，所述利用毕赤酵母制备粗酶液包括以下步骤：

f1.将菌株进行平板活化，并进行过夜培养，再接入新鲜BMGY培养基中，待OD₆₀₀达到1.8～2.5时，加入BMMY进行诱导培养；

f2.对BMGY培养基进行离心洗涤，收集上清液，即为粗酶液，并于3～5℃条件下存储。

5.根据权利要求4所述的融合酶的制备方法，其特征在于：

在步骤f1中，对阳性菌进行诱导表达的时间为144～146h。

6.根据权利要求1所述的融合酶的制备方法，其特征在于：

所述进行融合酶的分离纯化的过程中，利用组氨酸标签与镍柱的特异性结合进行分离纯化。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的融合酶的制备方法，其特征在于，所述将融合酶质粒转入到毕赤酵母中进行发酵表达包括以下步骤：

c.制备毕赤酵母感受态细胞；

d.将融合酶质粒电转进入感受态毕赤酵母细胞；

e.提取毕赤酵母中的质粒，并验证质粒的转导情况。

8.根据权利要求7所述的融合酶的制备方法，其特征在于，在步骤c中，包括以下步骤：

c1.用YPD培养基，从甘油菌接种，对毕赤酵母细胞进行活化；

c2.将活化的毕赤酵母细胞重新接种到新的YPD培养基中，等OD₆₀₀值达到1.2～1.5时，进行离心；

c3.将离心后静置获得的沉淀物用预冷的无菌水吹打混匀，再次离心；

c4.用预冷的山梨醇与步骤c3获得的沉淀物混匀，而形成毕赤酵母感受态细胞；

且步骤c3重复进行2～4次。

9.根据权利要求7所述的融合酶的制备方法，其特征在于：

在步骤e中，采用PCR技术复制从毕赤酵母中提取的质粒，并利于DNA电泳验证质粒的转导情况。

10.一种融合酶，其特征在于：该融合酶由6×His-SUMO标签与非特异性过氧化酶的突变体JaWa、SoLo、WamPa相结合而成。