[发明专利]一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法

权利要求书

1.一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，包括：

将切碎后的新鲜神经组织与细胞解离消化液混合培养后，离心，加入内皮细胞培养液，过滤后得到细胞混合物；

将所述细胞混合物与细胞梯度分离液混合，纯化分离内皮细胞；

其中，所述细胞梯度分离液是通过将第一溶液按照体积比1:0.9～1.1加到第二溶液的上方，所述第一溶液中含有质量浓度为8～10％的硅胶颗粒，所述第二溶液中含有质量浓度为12～14％的硅胶颗粒，所述硅胶颗粒中包覆有乙烯吡咯烷酮。

2.根据权利要求1所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述第一溶液的配制方法为将含有所述硅胶颗粒的细胞分离液与所述内皮细胞培养液按照体积比13～17：183～187混合；

优选地，所述第二溶液的配制方法为将含有所述硅胶颗粒的细胞分离液与所述内皮细胞培养液按照体积比19～23：177～181混合；

所述细胞分离液中所述硅胶颗粒的质量浓度为1.2～1.4g/mL。

3.根据权利要求1所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述纯化分离内皮细胞的步骤包括：

将所述细胞混合物与细胞梯度分离液混合，得到完整的内皮细胞梯度分离液，将所述内皮细胞梯度分离液在室温下2000～2500g离心15～20min，去除最上层的内皮细胞培养基，以及最下层的其它神经系统细胞及死细胞，保留中间部分的内皮细胞层，洗涤。

4.根据权利要求3所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，洗涤所述内皮细胞层的步骤包括：

将所述内皮细胞层与所述内皮细胞培养液混合后，在室温下150～250g离心1～3min，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到神经系统内皮细胞单细胞混悬液。

5.根据权利要求3或4所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述纯化分离内皮细胞步骤中的离心采用水平转子离心机。

6.根据权利要求1所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，在制备所述细胞混合物的过程中，将所述新鲜神经组织与所述细胞解离消化液混合后于30～34℃下恒温培养30～60min，期间每隔1～4分钟机械混匀一次。

7.根据权利要求6所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述恒温培养后，离心过程中离心力为150～250g，离心时间为3～5min。

8.根据权利要求1所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，在制备所述细胞混合物的过程中，用孔径为35～45μm的细胞筛进行过滤。

9.根据权利要求1或2所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述内皮细胞培养液中至少含有：青霉素/链霉素双抗、DMEM培养基和胎牛血清。

10.根据权利要求9所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述细胞解离消化液是在所述内皮细胞培养液中加入1～5mg/mL的Pronase E蛋白酶和20～30U/mL的DNase I配制的。