[发明专利]一种稳定的大分子I型重组胶原蛋白及其用途

说明书

本发明涉及一种稳定的大分子I型重组胶原蛋白及其用途。本发明的大分子I型重组胶原蛋白由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成，所述短氨基酸序列为G A P G A P G S Q G A P G L Q，重复次数为75～110次。本发明的大分子I型重组胶原蛋白具有极其良好的在水溶液中的稳定性，可在水溶液中长期保存。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型的基因工程重组胶原蛋白及其用途。

背景技术

胶原蛋白是一种生物高分子蛋白，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～ 30％。胶原蛋白与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系，是生物科技产业最关键的原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业中均有广泛应用。

天然的人胶原蛋白来源受限，目前工业上使用的天然胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取动物的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，其主要来源为动物结缔组织。但从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险，同时大规模的制备对供给侧的动物饲养造成巨大的压力。

随着基因工程技术的广泛应用，通过采用合适的工程菌株(大肠杆菌、毕赤酵母等)外源性表达人胶原蛋白，成功地解决了人胶原蛋白大规模制备的瓶颈问题。但是，利用工程菌株例如毕赤酵母基因工程菌株表达人胶原蛋白时，人胶原蛋白会在发酵、纯化及保存过程中发生降解，这增加了生产成本，并且影响了这种方法生产的人胶原蛋白的性能。

推测人胶原蛋白发生降解的原因可能是其氨基酸序列中含有较多的易发生水解的位点。因此，技术人员通过选择来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列进行重复来构建重组胶原蛋白，以期回避易发生水解的位点，从而提高胶原蛋白的稳定性，同时还能保持天然人胶原蛋白的优良性能。但是，通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白，其氨基酸组成及分布都相对单调，理论上讲，这会造成其表面的电荷负载大，整体不容易达到稳定的平衡状态，因而在水溶液中容易水解、变性，且存在短氨基酸序列重复单元越短、重复次数越多，重组胶原蛋白分子在水溶液中越不稳定的倾向。

可以尝试通过对来自天然胶原蛋白的短氨基酸序列进行突变并以此作为重复单元，从而获得更耐降解的重组胶原蛋白。但是，这样通过突变改造得到的重组胶原蛋白与天然人胶原蛋白的同源性降低，可能出现免疫原性问题，因而不适合应用于需与人体长期接触的生物材料。

另一方面，组织工程材料例如皮下填充剂等是人胶原蛋白的一个重要应用方向，作为组织工程材料，要求胶原蛋白具有良好的力学强度和在水溶液中的稳定性(可在水溶液中长期保存)。一般而言，胶原蛋白的分子量越大，其力学强度就越好，而其在水溶液中的稳定性越差，对于通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白而言更是如此。

天然人胶原蛋白的每条链的分子量约为110-130kD，从实用性的观点出发，技术人员普遍认为适合替代天然人胶原蛋白用作组织工程材料的胶原蛋白的分子量需要达到100kD以上。然而，正如前述，天然的人胶原蛋白来源受限，动物源胶原蛋白存在传播疾病的风险，基因工程表达的人胶原蛋白容易在发酵、纯化及保存过程中发生降解，通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白在水溶液中不稳定，而通过突变改造得到的重组胶原蛋白又存在免疫原性问题，因此，如何获得适合替代天然人胶原蛋白用作组织工程材料的胶原蛋白成为本技术领域的限制性问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，发明人进行了深入研究。发明人首先对通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白进行了技术文献调研，选取了现有技术中的一些来自天然人I型胶原蛋白(应用最广泛的组织工程材料)的短氨基酸序列，然后分别将这些短氨基酸序列作为重复单元，构建不同分子量的重组胶原蛋白，考察这些重组胶原蛋白在水溶液中长期保存的稳定性，以期获得能够在水溶液中长期稳定保存且能够满足作为组织工程材料的力学强度要求的大分子量(100kD以上)重组胶原蛋白。