[发明专利]一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法。本发明分别在RpHsfC1和RpHsfC1‑like基因的全长序列中选取一个目标片段，扩增目标基因片段与病毒载体重组，构建VIGS载体，将VIGS载体转化至杜鹃，通过荧光定量表达分析，结果发现经过VIGS沉默的目的基因的表达量受到抑制，说明成功沉默了目的基因，获得转基因植株。通过对沉默后植株进行光合荧光特征的分析，发现经过VIGS沉默掉目的基因RpHsfC‑1 like和RpHsfC‑1都对杜鹃耐热能力产生了影响。本发明通过初步鉴定基因的调控耐热能力，为杜鹃耐热性品种的培育提供了基因来源。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法。

背景技术

杜鹃是我国的著名花卉，又作为我国的传统十大名花，杜鹃花的地理分布非常广泛，杜鹃可以在从低海拔到高海拔的不同植被地带生长，但杜鹃花主要分布在海拔1500～4000m的地区，喜冷凉的环境。目前随着全球气候变暖的加剧，高温已经成为全球性的自然灾害，涉及范围较广，然而温度是影响植物生长发育的重要因素，不适宜的生长温度极易影响植物的生长代谢。目前栽培的大多数杜鹃优良品种的耐热性较差，当温度超过35℃时，植物会进入半休眠状态，新梢和新叶的生长也会变得缓慢。目前关于高温胁迫对杜鹃的研究较多，但是大多数还局限在生理生化指标的分析，对杜鹃耐热性研究在分子生物学上的研究还较少，因此对杜鹃耐热相关基因的发掘为今后杜鹃的分子遗传育种具有重要理论和实践意义。热激转录因子(Hsfs)是调控编码热激蛋白(Hsps)的热激(HS)响应基因的核心调控因子，Hsps是一类最为重要的热胁迫蛋白，是植物细胞免受高温伤害的物质基础。目前关于耐热性与热激蛋白和热激转录因子的研究还大多集中在拟南芥、番茄、甜椒和黄瓜等植物中，在杜鹃还尚未广泛开展此类研究。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，目的是为了解决前关于高温胁迫对杜鹃的研究较多，但是大多数还局限在生理生化指标的分析，对杜鹃耐热性研究在分子生物学上的研究还较少，以及杜鹃还尚未广泛开展关于耐热性与热激蛋白和热激转录因子的研究的技术问题。

本发明提供的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，具体技术方案如下：

一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，构建含有用于沉默耐热基因特异性片段的重组病毒载体，转化到农杆菌感受态细胞制备侵染菌液，将所述侵染菌液侵染的杜鹃，对所述耐热基因的功能进行鉴定分析，所述用于沉默耐热基因特异性片段为用于沉默RpHsfC-1 like基因特异性片段或用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段，所述用于沉默RpHsfC-1 like基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在某些实施方式中，包括如下步骤；

S1，提取杜鹃叶片RNA，反转录获得杜鹃cDNA；

S2，利用引物1和引物2对进行杜鹃cDNA片段PCR扩增，纯化获得用于沉默RpHsfC-1like基因特异性片段，利用引物3和引物4对进行杜鹃cDNA片段PCR扩增，纯化获得用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段；

S3，将步骤S2中的用于沉默RpHsfC-1 like基因特异性片段、用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段分别与烟草脆裂病毒pTRV2进行重组连接，获得重组载体pTRV2-HsfC-1like、pTRV2-HsfC-1；

S4，将步骤S3中重组载体pTRV2-HsfC-1 like、pTRV2-HsfC-1以及pTRV1分别转化到农杆菌GV3101 感受态细胞，PCR鉴定阳性，分别获得含重组载体pTRV2-HsfC-1 like的菌液、含重组载体pTRV2-HsfC-1的菌液以及含pTRV1的菌液；