[发明专利]一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法

说明书

本发明涉及一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法。包括步骤如下：(1)制备海藻酸铜水凝胶和焦磷酸钠溶液；(2)制备梯度浓度的碱性磷酸酶标准溶液和甲胎蛋白标准溶液；(3)绘制碱性磷酸酶标准曲线；(4)绘制甲胎蛋白标准曲线；(5)检测待测样品中碱性磷酸酶和甲胎蛋白的含量。本发明提供的基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法，具有操作过程简单，成本低，试剂消耗少等优点，碱性磷酸酶的检测限为1.7mU/mL，甲胎蛋白的定量检测限为0.8ng/mL，有效地解决了现有检测方法复杂、成本高的问题，为临床诊断和应用提供了发展前景。

技术领域

本发明提供了一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法，属于检测分析技术领域。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP)是广泛分布在动物体内最重要的水解酶之一，它能催化生物分子去磷酸化，调节细胞生长、凋亡、信号转导等细胞周期过程。在临床诊断中，ALP作为重要的生物标记物可指示多种疾病，例如糖尿病，骨骼疾病，前列腺癌和肝功能异常等。此外，ALP由于其催化活性高、稳定性好、底物特异性广、易于与抗体结合等特点，被广泛用于酶联免疫吸附试验(ELISA)中作为标记酶。标记酶的高特异性抗原-抗体识别和高效的生物催化特性使ELISA已经成为临床诊断、食品质量控制、环境监测和实验室研究中最广泛使用的免疫分析形式。

甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，它属于白蛋白家族，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成。甲胎蛋白在胎儿血液循环中具有较高的浓度，出生后则下降，至生后2～3月甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中较难检出，故在成人血清中含量极低。甲胎蛋白具有很多重要的生理功能，包括运输功能、作为生长调节因子的双向调节功能、免疫抑制、T淋巴细胞诱导凋亡等。甲胎蛋白与肝癌及多种肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中均可表现出较高浓度，可作为多种肿瘤的阳性检测指标。目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。一般情况下，健康成人的AFP浓度低于25ng/mL，而肝癌的病理变化值可能会超过400ng/mL。

因此，对AFP的临床分子诊断显得十分重要，目前已报道的测定AFP免疫检测方法有荧光免疫法、电化学免疫法、化学发光免疫法和放射免疫法，尽管这些方法对灵敏检测生物标志物做出了巨大贡献，但必须提供和获得复杂的仪器和熟练的专业操作人员。因此，迫切需要开发一种技术简单、绿色、方便的免疫分析方法。即时诊断(POCT)技术产品降低了对配套设备和操作专业性的要求，可用于现场快速检测和疾病前期筛查诊断，可应用到基层医疗单位或在资源有限的偏远地区实现患者在家中实现自检。纸张具有天然的网状多孔结构，因而其比表面积较高，有助于分析物的扩散以及材料的固定化，大大缩短了分析时间。纸张资源丰富且成本很低，易于通过简单的加工技术进行批量化的生产，柔性可折叠的纸张更易于形成双层甚至3D构架的流体通道同时连接实现灵活的流体控制。此外，纸张可燃且生物相容性好，避免环境污染，轻薄柔性，利于运输。并且纸基不需要凭借其它的外力仅通过纸本身的毛细管作用便可以实现流体的运输。

综上所述，开发一种利用纸基，能够简单快速、灵敏检测碱性磷酸酶(ALP)和甲胎蛋白(AFP)浓度的分析方法在临床研讨中起着重要的研究意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法。在无需复杂的仪器和操作程序的情况下，实现对碱性磷酸酶以及肿瘤标志物甲胎蛋白的即时检测。

本发明的技术方案如下：

一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法，包括步骤如下：

(1)向海藻酸盐溶液中添加铜离子溶液，混合均匀，得到海藻酸铜水凝胶；将焦磷酸钠溶于HEPES缓冲溶液中，得到焦磷酸钠溶液；

(2)将碱性磷酸酶标准品溶解于HEPES缓冲液中，得到梯度浓度的碱性磷酸酶标准溶液；将甲胎蛋白母液用PBS缓冲溶液稀释，得到梯度浓度的甲胎蛋白标准溶液；