[发明专利]一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法

权利要求书

1.一种基于铜离子响应焦磷酸根的以非诊断目的检测碱性磷酸酶或甲胎蛋白的检测方法，包括步骤如下：

（1）向海藻酸盐溶液中添加铜离子溶液，混合均匀，得到海藻酸铜水凝胶；将焦磷酸钠溶于HEPES缓冲溶液中，得到焦磷酸钠溶液；

所述海藻酸盐为海藻酸钠，浓度为0.2 wt%；所述铜离子溶液为硫酸铜溶液，浓度为2mM，海藻酸盐溶液和铜离子溶液的体积比为1:1；所述焦磷酸钠溶液中焦磷酸根的浓度为1.5mM；

（2）将碱性磷酸酶标准品溶解于HEPES缓冲液中，得到梯度浓度的碱性磷酸酶标准溶液；将甲胎蛋白母液用PBS缓冲溶液稀释，得到梯度浓度的甲胎蛋白标准溶液；

（3）向步骤（2）制备的碱性磷酸酶标准溶液中添加焦磷酸钠溶液，混合均匀后在35~40℃下孵育50~70min，继续添加海藻酸铜水凝胶，然后将碱性磷酸酶混合物滴到pH试纸条的一端，爬行2~5min，测量碱性磷酸酶混合物在pH试纸条上的移动距离，绘制碱性磷酸酶标准曲线；所述碱性磷酸酶混合物的滴加量为30~40μL；

（4）向涂有包被抗体的微孔板中加入甲胎蛋白标准溶液，用封板膜盖上，振荡混匀，在35~40℃下孵育40~50 min后，用洗涤液洗涤3次，拍干；加入生物素标记的检测抗体，在37℃下孵育30 min，用洗涤液洗涤3次，拍干；加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，反应20~40min，用洗涤液洗涤3次，拍干；继续加入焦磷酸钠溶液，在35~40℃下孵育50~70 min；然后将孵育液添加至海藻酸铜水凝胶中，混合均匀，然后将甲胎蛋白混合物滴到pH试纸条的一端，爬行2~5min，测量甲胎蛋白混合物在pH试纸条上的移动距离，绘制甲胎蛋白标准曲线；所述碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的浓度为1 μg/mL，所述检测抗体、焦磷酸钠溶液、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和海藻酸铜水凝胶的体积比为1:1:1:1；

（5）将含碱性磷酸酶的待测样品溶解于HEPES缓冲溶液中，得到待测样品溶液，按照步骤（3）的方法测定待测样品混合物在pH试纸条上的移动距离，对照碱性磷酸酶标准曲线，得到待测样品中碱性磷酸酶的含量；将含甲胎蛋白的待测样品溶解于PBS缓冲溶液中，得到待测样品溶液，按照步骤（4）的方法测定待测样品混合物在pH试纸条上的移动距离，对照甲胎蛋白标准曲线，得到待测样品中甲胎蛋白的含量。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述碱性磷酸酶标准溶液和焦磷酸钠溶液的体积比为1:1；所述碱性磷酸酶标准溶液和海藻酸铜水凝胶的体积比为1:1。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，在pH试纸条上爬行时间为3min。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中，所述pH试纸条为广范试纸条，尺寸为4 mm×60 mm。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中，所述微孔板为96孔板，包被抗体为甲胎蛋白捕获抗体，检测抗体为生物素标记的甲胎蛋白检测抗体。

6.权利要求1所述基于铜离子响应焦磷酸根的以非诊断目的检测碱性磷酸酶或甲胎蛋白的检测方法在检测血清中碱性磷酸酶或甲胎蛋白中应用。