[发明专利]基于光栅投影和SLM相移的结构光照明显微装置及方法

说明书

本发明公开了一种基于光栅投影和SLM相移的结构光照明显微装置和方法，所述装置包括依次设置的结构光产生单元、相移及光强调制单元和成像单元，其中，结构光产生单元用于产生多束沿不同方向传播的平行光并干涉形成条纹结构光；相移及光强调制单元中的空间光调制器上能够加载不同图样以对条纹结构光同时进行方向选择和相移操作，空间掩膜板用于对条纹结构光进行滤波，使得仅保留每个方向上±1级衍射光而滤掉其它的衍射光；成像单元用于利用滤波后的条纹结构光照明样品并记录在不同条纹结构光照明下的荧光图像。本发明在保持高分辨率的情况下仍然具有高通量成像范围，克服了传统结构光照明显微镜成像通量受SLM或DMD本身像素个数限制的问题。

技术领域

本发明属于显微成像技术领域，具体涉及一种基于光栅投影和SLM相移的结构光照明显微装置及方法。

背景技术

光学显微装置以其结构简单、易操作、损伤低等优势成为观测微观世界的重要手段，被广泛应用于生命科学及生物医学领域。然而，传统光学显微只能获取样品的强度信息，对大多数生物样品(透明或半透明的)成像时，存在图像对比度低的缺点。荧光显微技术利用化学染料或荧光蛋白对细胞进行特异性标记，可以高衬度地观测样品的特定结构。然而，受到物理衍射极限的限制，光学显微镜的空间分辨率一般只有照明光波长的1/2，通常为200nm左右。

超分辨光学显微技术能够超越光学衍射极限并获得几十甚至几个纳米的空间分辨率，彻底改变了光学显微镜的历史，在生物医学和化学科学中发挥着至关重要的作用。在过去的30年中，已经出现了各种超分辨光学显微技术，如STORM(Stochastic OpticalReconstruction Microscopy，随机光学重建显微)、SMLM(Single-molecule LocalizationMicroscopy，单分子定位显微)、STED(Simulated Emission Depletion Microscopy，受激发射损耗显微)和SIM(Structured Illumination Microscopy，结构光照明显微)。其中，STED通过将激发焦点与额外的环形损耗光叠加，减小了传统激光扫描共焦显微镜的有效焦点(即PSF(Point Spread Function，点扩散函数))的大小，从而提高了成像空间分辨率。SMLM的核心思想是以化学或物理方式控制荧光染料或蛋白质分子，使得在每一帧中只有离散的一小部分分子发出荧光信号；通过对这些荧光点进行高精度高斯峰拟合来确定这些稀疏分布分子的横向位置以实现超分辨重构。SMLM通常需要记录数千张图像来重建一幅具有几十纳米左右分辨率图像，时间分辨率较差。理论上，STED和SMLM都具有无限高的分辨率，甚至可以到原子尺度。然而，在实际成像中，STED和SMLM的实际空间分辨率受到成像系统中的光学像差、背景噪声、自发荧光，所使用的荧光团的亮度、光稳定性和标记密度有限、SNR(Signal-to-noise Ratio，成像信噪比)等多种因素的限制，两者目前报道的最高空间分辨率分别为40nm和20nm。

相比STED和SMLM，SIM技术具有成像速度快、照明光剂量小、样品制备简单以及对荧光标记物和标记程序没有特殊要求等优点，成为了研究活细胞结构和动态过程的首要成像手段。SIM利用不同方向、不同相移量的条纹结构光照亮样品并依次记录生成的干涉图样，利用结构光和样品之间的“莫尔效应”将传统光学显微镜无法检测的高频信息平移到低频空间顺利通过光学系统，最后利用超分辨重构算法便可获取样品的超分辨图像。当荧光发射与激发强度呈线性响应时，线性SIM的空间分辨率增强最高可达两倍；当荧光信号与激发光光强呈非线性响应时(具有高次谐波)，非线性SIM中的分辨率增强可以超过两倍。