[发明专利]一种抗人神经生长因子抗体的电荷变异体检测方法

说明书

本发明公开了一种抗人神经生长因子抗体的电荷变异体检测方法。条件为：Thermo DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪；Sepax Protemix SCX‑NP5色谱柱；柱温25℃；流动相A为4mM Tris‑4mM咪唑‑4mM哌嗪溶液(pH＝5.0)；流动相B为4mM Tris‑4mM咪唑‑4mM哌嗪‑0.25M NaCl溶液；洗脱程序：0min起，100％体积的流动相A；9min～15.5min，80％体积的流动相A和20％体积的流动相B。本发明的方法可快速对大批量样品进行检测，准确性高、重复性好、样品处理后稳定，同时操作简单、成本低、通用性高、适用性良好。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种抗人神经生长因子抗体的电荷变异体检测方法。

背景技术

抗人神经生长因子抗体是IgG₄单克隆抗体，通过与神经生长因子结合从而阻断疼痛传递通路，对骨关节炎、骨折疼痛、类风湿关节炎、痛风关节痛、神经性疼痛等疼痛性疾病方面具有广泛的治疗作用。在生产、储存和运输等过程中，单克隆抗体会与溶液中的物质产生分子间相互作用，表面残基会发生多种化学或酶修饰，从而使得单抗变成一种带有轻微静电差异的电荷变异体混合物。电荷变异体通常依据其相对于主峰的等电点(PI)，分为酸性或碱性变异体。一般地，酸性变异体具有相对主峰较低的PI，而碱性变异体则具有相对主峰较高的PI。通过对其不同的组分进行分析，从而确定其表面残基的修饰类型。

目前在生物制药行业中，离子交换色谱作为单抗电荷变异体分析的“金标准”被广泛使用。该法采用高效液相色谱仪，通过离子交换对可解离物质进行分离测定。基于流动相的不同，分为盐洗脱和pH洗脱两种类型。基于洗脱程序的不同，分为梯度和等度洗脱两种类型。

按照本领域的常规方法，PI为7.5～8.0的IgG抗体，采用阳离子色谱柱进行分析；反之，PI低于7.5的IgG抗体，则用阴离子色谱柱。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人神经生长因子抗体的电荷变异体检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种抗人神经生长因子抗体的电荷变异体检测方法，其特征在于，将含有抗人神经生长因子抗体的检测样品进行HPLC检测；

其中HPLC检测时的色谱仪为Thermo DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪；色谱柱为Sepax Protemix SCX-NP5，规格为4.6mm×250mm×5μm；色谱柱温度为25℃；

流动相：流动相A为4mM Tris-4mM咪唑-4mM哌嗪溶液，其pH＝5.0；流动相B为4mMTris-4mM咪唑-4mM哌嗪-0.25M NaCl溶液；

流动相流速：1.00mL/min；

UV检测波长：280nm；

洗脱程序：0min起，流动相为100％体积的流动相A；9min～15.5min，流动相为80％体积的流动相A和20％体积的流动相B；16.5min～24.5min，流动相为100％体积的流动相B。

进一步，所述含有抗人神经生长因子抗体的检测样品中的抗人神经生长因子抗体的的浓度为0.750mg/ml～2.250mg/ml。

抗人神经生长因子抗体的PI约为6.5，按照常识，发明人选用阴离子色谱柱对其电荷变异体进行分析。但是其色谱图显示主峰与酸峰之间拐点不明显，碱峰只有一个，分离度低，结果并不理想。因此本发明的发明人尝试性地将阴离子交换色谱柱换成阳离子交换色谱柱对抗人神经生长因子抗体进行电荷变异体分析，结果显示各组分间拐点较阴离子柱的明显。后续不断对流动相、洗脱方法进行优化，得到了本发明的技术方案。