[发明专利]一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用

说明书

本发明公开了一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用，以植物矮牵牛作为研究对象，采用转录组测序和VIGS相结合的技术，首先构建TRV病毒侵染的差异表达基因数据库，从中选择极显著差异表达转录因子作为候选基因；分别构建至TRV‑GFP‑PhPDS载体，利用双报告基因分别监测病毒积累与RNA沉默过程；接种矮牵牛后，以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，在上调表达转录因子中，导致绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制的基因认定为正调控转录因子，在下调表达转录因子中，造成绿色荧光减弱、光漂白表型受到促进的基因认定为负调控转录因子。本发明为研究植物抗病毒RNA沉默转录调控机理提供了一种简单、快速、有效的基因筛选方法。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用。

背景技术

RNA沉默是植物抵抗病毒入侵的重要防御机制，该沉默机制需要多种关键酶基因的参与，包括DCLs、AGOs、RDRs、DRBs等，它们分别负责病毒dsRNA的识别与剪切、siRNA的形成与稳定、dsRNA的二次合成等过程。然而至今，针对这些酶基因表达起着重要调控作用的转录因子却少有报道。因此，采用何种技术挖掘RNA沉默通路关键转录因子是一个亟待解决的重要科学问题。

目前，上游转录因子的筛选多采用酵母单杂交技术，通过对酵母细胞内报告基因表达情况的分析来鉴别特定的DNA结合位点，帮助发现潜在的结合蛋白(即转录因子)。但是，该技术操作繁琐、成本偏高、灵敏度较差，目的基因片段可能会被漏检，有一定假阳性或假阴性的比率，且每次实验仅能针对单一基因进行筛选，难以筛选出同时调控同一途径中多个基因的转录因子。

基于RNA沉默的病毒防卫原理，科研人员开发出了一种下调基因表达的反向遗传学技术，即病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)。该技术以人工改造的病毒为载体，将目标基因片段构建其中，依靠农杆菌介导侵染后，可引起寄主植物体内同源基因表达水平的下降。VIGS技术具有操作简单、成本较低、便于表型快速观察等优势，现已发展成为高通量基因筛选与功能研究的强有力工具。

由于VIGS技术是抗病毒RNA沉默机理的一种外在应用形式，两者原理共通，VIGS沉默效率可以准确反映出RNA沉默程度，因此以模式植物矮牵牛为研究对象，以VIGS技术为实验手段，采用候选转录因子与报告基因联合构建方式，以可观察的报告基因沉默表型差异作为判断依据，是一种筛选调控抗病毒RNA沉默途径关键转录因子的新方法。发明人前期研究发现，将矮牵牛抗病毒RNA沉默正调控转录因子PhOBF1和PhERF2基因片段构建至TRV-PhPDS载体中，侵染后导致光漂白表型受到抑制，提高了病毒积累量，并降低了RNA沉默通路中相关基因的表达水平，从而在理论和实践上证明了该方法的有效性。目前，该筛选方法还存在如下不足和缺陷：1)用于抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选的候选基因来源十分缺乏；2)在VIGS技术中用于监测抗病毒RNA沉默过程的报告基因类型尚待确定；3)以VIGS沉默表型为关键转录因子的判断依据仍然不够细化。

发明内容

针对上述现有技术不足与缺陷，本发明的目的在于，提供一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及其应用，解决了现有技术中存在的操作繁琐、成本偏高、灵敏度较差、筛选效率低下、针对基因单一等问题。

为了达到上述目的，本申请采用如下技术方案予以实现：

本发明公开一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，所述植物抗病毒RNA沉默相关转录因子包括植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子和植物抗病毒RNA沉默负调控转录因子，包括以下步骤：

步骤1：采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株，接种后取样，利用转录组测序技术建立烟草脆裂病毒侵染的矮牵牛叶片差异表达基因数据库；

步骤2：从所述矮牵牛叶片差异表达基因数据库中选择极显著上调表达的转录因子和极显著下调表达的转录因子，排除非抗性相关基因，剩余作为候选转录因子；