[发明专利]一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用

权利要求书

1.一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，所述植物抗病毒RNA沉默相关转录因子包括植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子和植物抗病毒RNA沉默负调控转录因子，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株，接种后取样，利用转录组测序技术建立烟草脆裂病毒侵染的矮牵牛叶片差异表达基因数据库；

步骤2：从所述矮牵牛叶片差异表达基因数据库中选择极显著上调表达的转录因子和极显著下调表达的转录因子，排除非抗性相关基因，剩余作为候选转录因子；

步骤3：以烟草脆裂病毒为载体，绿色荧光蛋白和矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶基因为报告基因，将步骤2中所述候选转录因子的基因片段依次构建至烟草脆裂病毒-绿色荧光蛋白-矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶载体中，得到烟草脆裂病毒载体的重组质粒；

步骤3具体包括：采用酶切连接法，首先将矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶基因片段构建至烟草脆裂病毒-绿色荧光蛋白载体SacI、XhoI酶切位点之间，形成烟草脆裂病毒-绿色荧光蛋白-矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶载体，然后将候选转录因子的基因片段构建至载体的BamHI、KpnI酶切位点之间，得到烟草脆裂病毒载体的重组质粒；

步骤4：将烟草脆裂病毒载体的重组质粒转化进农杆菌菌株中，利用农杆菌介导法注射接种矮牵牛小苗，观察接种后矮牵牛小苗叶片绿色荧光信号强度及系统叶片光漂白表型程度；接种的矮牵牛小苗放在20℃光照时长15～17h，18℃黑暗时长7～9h条件下培养；

以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，在上调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制的基因认定为植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子；在下调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光减弱、光漂白表型受到促进的基因认定为抗病毒RNA沉默负调控转录因子，完成筛选。

2.如权利要求1所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，其特征在于，步骤1中采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株具体包括：首先采集保存烟草脆裂病毒的活体植株叶片，研磨后加入磷酸缓冲液，过滤，制备病毒侵染液；

接着在4-6叶期的矮牵牛植株幼嫩叶片表面撒上金刚砂，采用机械摩擦法，蘸取病毒侵染液，在叶片表面轻抹数次进行病毒接种。

3.如权利要求2所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液浓度为95～105mM，pH为6.8～7.2。

4.如权利要求1所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，其特征在于，步骤4中所述农杆菌菌株为GV3101。