[发明专利]一种巴氏生孢八叠球菌的培养方法

说明书

本发明涉及微生物发酵工程技术领域，尤其是涉及一种巴氏生孢八叠球菌的培养方法。本发明首先将巴氏生孢八叠球菌在固体活化培养基中进行活化，得到活化菌种；然后将活化菌种接种至液体种子培养基中进行培养，从中选取单位脲酶活性高于5.0U/ml/OD₆₀₀的菌液作为种子液；最后将种子液接种至液体芽孢培养基中发酵培养，得到具有高单位脲酶活性及高形孢密度的巴氏生孢八叠球菌。本发明通过连续三个阶段的培养，在获得高单位脲酶活性巴氏生孢八叠球菌的同时获得高形孢密度的巴氏生孢八叠球菌，并大幅缩短培养周期，降低生产成本，且本发明操作简便，具有很强的实用性。

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程技术领域，尤其是涉及一种巴氏生孢八叠球菌的培养方法。

背景技术

作为一种脆性材料，混凝土在外界环境因素作用下容易发生开裂形成微裂缝。尽管微裂缝对混凝土力学性能造成的负面影响可忽略不计，但这些微裂缝为外界二氧化碳、硫酸根、氯离子等侵蚀性物质进入混凝土内部提供通道，从而引起混凝土结构的劣化及内部钢筋的锈蚀，严重影响混凝土耐久性，并进一步造成力学性能损失。传统修复裂缝的方式是人工定期检修和维护，但费工费力，且某些特殊部位的裂缝修复难以施工。目前，通过预埋微生物矿化组分已能够实现混凝土微裂缝的主动愈合。其中常用的微生物制剂主要为巴氏生孢八叠球菌，该类菌种能大量分泌脲酶，可发挥催化作用快速分解尿素，从而诱导生成碳酸钙矿物并实现微裂缝的愈合，避免外界侵蚀性物质的进入混凝土内部。

然而预埋微生物矿化组分是在混凝土拌合阶段，由于混凝土搅拌的高剪切应力、水泥水化热以及水化产生的高碱性环境将对微生物造成损伤，而混凝土后期硬化的孔径减小以及内部的持续干燥也对微生物的存活造成很大压力。

在营养物质耗尽等不利条件下，巴氏生孢八叠球菌会逐渐形成休眠的芽孢体，具有很强的抗逆性，能够抵抗高碱性、高温、干旱等恶劣环境。将微生物直接以休眠态的方式引入到混凝土内部，可避免上述过程对微生物造成的负面影响。当混凝土发生开裂时，外部氧气和水分的进入，将激活预埋芽孢并进行萌发和生长，进而诱导矿化沉积，以实现混凝土微裂缝的主动愈合。然而在培养微生物过程中，采用市面常见的培养手段所培养的微生物不仅脲酶活性较低，其芽孢的生成密度亦偏少，阻碍了其在混凝土裂缝自修复中的应用。

李萌等以ATCC11859的巴氏芽孢八叠球菌为出发菌株，采用亚硝基胍诱变以提高菌株产脲酶的能力，其所获得的单位脲酶活性最高为1U/ml/OD₆₀₀。然而诱变方法操作复杂，随机性高；亚硝基胍在碱性条件下会形成重氮甲烷，其受到撞击后会导致爆炸，操作过程极度危险；亚硝基胍也是一种强烈的致癌物质，对操作人员极易造成伤害。另外，该方法未涉及菌株高形孢密度的培养。

CN107723259A公开了一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法，包括采用A和B顺序的双培养基培养巴氏生孢八叠球菌，在单菌落培养和菌种复活阶段采用A培养基，在菌种扩大培养阶段采用B培养基，该技术方案无法形成高形孢密度的菌株。

CN112553121A公开了一种耐高温芽孢杆菌超高密度固体发酵方法，包括首先在LB固体培养基中活化，再转接至LB液体培养基中培养，最后固体发酵，该技术方案无法形成高的芽孢密度，且无法同时产生高单位脲酶活性。

因此，提出了一种针对巴氏生孢八叠球菌的高单位脲酶活性及高形孢密度培养方法是非常重要的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种巴氏生孢八叠球菌的培养方法，本发明首先将巴氏生孢八叠球菌在固体活化培养基中进行活化，得到活化菌种；然后将活化菌种接种至液体种子培养基中进行培养，从中选取单位脲酶活性高于5.0 U/ml/OD₆₀₀的菌液作为种子液；最后将种子液接种至液体芽孢培养基中发酵培养，得到具有高单位脲酶活性及高形孢密度的巴氏生孢八叠球菌。本发明通过连续三个阶段的培养，在获得高单位脲酶活性巴氏生孢八叠球菌的同时获得高形孢密度的巴氏生孢八叠球菌，并大幅缩短培养周期，降低生产成本，且本发明操作简便，具有很强的实用性。