[发明专利]一种尿液样本的前处理方法、保存方法、自动化处理系统及检测方法

说明书

本发明公开了一种尿液样本的前处理方法、保存方法、自动化处理系统及检测方法，涉及生物检测技术领域，该前处理方法包括将经过蛋白裂解后的尿液样本进行还原烷基化处理，然后进行蛋白富集、酶解；蛋白富集是采用PVDF过滤板对还原烷基化处理后的样本进行蛋白富集。本发明还提供了尿液样本的自动化处理系统及样本自动化处理方法，该处理系统极大程度上降低了人们的劳动强度，有利于加快尿液样本处理的处理效率，满足高通量、自动化的蛋白质组学前处理需求，适应当前临床需求的重现性和通量。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种尿液样本的前处理方法、保存方法、自动化处理系统及检测方法。

背景技术

尿液中蛋白质种类和数量的变化携带有泌尿系统疾病发生、发展及预后的多种信息，而尿液蛋白质组学是诠释尿液蛋白所携带信息的最有效的方法之一。在临床应用领域，常常需要多中心、大样品来进行研究分析，以便得到更准确的结果。而尿液样本由于体积大、蛋白浓度差异大以及存在细菌等微生物特征，因此如何优化临床尿液样本的保存是如今亟需解决的问题之一。

尿液样本具有收集简单、无创、快速等优势，在科学研究等领域获得了广泛的运用。但是尿液样本同样面临如何更长时间的保存、如何简化运送等难题，若其中一个环节质量控制的效果不好，均可能会影响蛋白检测结果的可靠性。常规条件下，尿液样本都是临床采集随后进行检测，或者存放于尿管中存放在样品库，但这样会占用冰箱中较大体积，不利于保存。此外，尿液中存在很多干扰化合物，如尿酸，肌酐，氨等非蛋白氮化合物、硫酸盐等，导致尿液的酸碱度变动很大，会加速尿液的腐化；同时，尿液中会存在细菌，在长期保存中细菌仍然存在活性，导致尿液中的蛋白质有被细菌分解的可能，影响最终结果的可靠性。而目前已有研究者提出，将尿液中的蛋白保存于膜上，这样就便于运输、占空间小、且可保存至少半年以上，但这里用到的膜材料面积也较大，约40mm左右，且保存尿液蛋白的操作只能单个样本进行，无法进行高通量处理，这就限制了膜材料保存尿蛋白的临床使用。

蛋白质组学(proteomics)，是以蛋白质组为研究对象，研究尿液、血清或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。1997年HEINE等用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱(high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-MS，HPLC-ESI-MS)技术鉴定出了34个蛋白质，并获得了正常人尿蛋白片段图谱。随后，LEE等采用质谱技术在尿液中鉴定出600种蛋白质分子，扩展了尿蛋白组数据库；随后，ADACHI等应用线性离子阱质谱(linear ion trap-orbitrap，LTQ-Orbitrap)技术鉴定出1543种尿蛋白；ALEX等应用二维凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)+LTQ-OrbitrapLC-MS/MS对正常人尿蛋白组分做了更为全面的分析，鉴定出2362种蛋白分子。

在过去的二十年中，基于质谱(MS)的方法已成为首选方法用于高可信度和深度覆盖的定量生物样品中的蛋白质，并极大地促进了生物体内的信号转导网络的注释，阐明蛋白质在不同生理病理状态下的相互作用，改善对疾病机理的诊断和分子理解。典型的蛋白质组学实验流程主要从蛋白质裂解(从样本中提取出蛋白质)、蛋白含量测定(测定溶液中蛋白质含量)、还原/烷基化(打开二硫键，使蛋白分子尽量从球状变成链状，增加蛋白质的溶解性，然后烷基化试剂与蛋白游离巯基结合，暴露出尽可能多的酶切位点)、蛋白酶解(胰蛋白酶将蛋白质样品消化成多个肽段)、脱盐(去除肽段溶液存在的无机盐成分并对肽段进行富集和浓缩冻干)、最后进行色谱-质谱检测分析。