[发明专利]一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，属于猕猴桃基因工程技术领域，其技术方案要点是：猕猴桃转化的方法包括下胚轴稳定转化和果实瞬时转化；下胚轴稳定转化的步骤如下：S1、猕猴桃种子播种；S2、下胚轴去顶保湿；S3、遗传转化载体构建；S4、农杆菌转化及侵染；S5、转基因植株鉴定；S6、稳定转化下胚轴体系建立；果实瞬时转化的步骤是：A.遗传转化载体构建；B.农杆菌转化；C.农杆菌菌液转入猕猴桃果实；D.瞬时转化果实体系建立。本发明主要用于建立稳定转化下胚轴体系和瞬时转化果实体系，利用该方法成功实现了稳定转化和果实瞬时转化，有效改变猕猴桃遗传转化再生率普遍低下的现状。

技术领域

本发明涉及猕猴桃基因工程技术领域，尤其涉及一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法。

背景技术

随着现代生物科技的不断发展，利用转基因手段对园艺作物进行遗传改良将成为重要的发展趋势。果树作物基因型高度杂合，童期长，造成传统的育种方式存在群体大，工作量大和耗时长等缺点。

在育种实践过程中，如何保持亲本优良性状且对个别劣质性状采用基因工程的手段加以修饰，快速选育出符合选育标准的优良品种成为育种家关注的热点问题。通过基因过表达和沉默表达技术对基因进行定向编辑是实现快速育种的重要手段之一。如何提高遗传转化效率成为基因编辑成功与否的关键因素。然而，研究表明，多年生木本植物普遍存在遗传转化效率低的棘手问题。

随着研究技术的发展，一些难转化的果树作物如葡萄、柑橘和苹果等转化效率已经得到显著提升。但猕猴桃的遗传转化效率仍然普遍较低(一般都在1％以下)，主要是因为猕猴桃的离体再生能力较差，转化体系还不健全，大大阻碍了转基因技术在猕猴桃上的应用。

遗传转化体系包括稳定转化和瞬时转化，稳定转化多见于组培苗植株，常用的方法为叶盘转化法，但该方法应用于猕猴桃上的转化效率仍较低，主要原因是猕猴桃属植物再生体系和遗传转化体系尚不完善，因此需要优化传统体系以及开发新的遗传转化体系。

下胚轴是具有一定胚性的营养器官，分裂分化比较旺盛，是比较好的遗传传话受体材料，在苹果、桃和番茄等园艺作物上已经被广泛使用，而在猕猴桃上尚未见报道。此外，瞬时转化也是验证基因功能常用的手段之一，由于获得的转基因植株需要渡过童期才可以开花结果，验证基因在果实发育中的功能比较漫长，因此，非常有必要建立一种有效的猕猴桃瞬时转化体系。

为了解决上述问题，在现有技术的基础上提供了一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，该方法建立了稳定转化下胚轴体系和瞬时转化果实体系，利用该方法成功实现了稳定转化和果实瞬时转化；且该方法具备操作简单、周期短、转化率高等优点，能够建立一种高效猕猴桃遗传转化体系，有效改变猕猴桃遗传转化再生率普遍低下的现状。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，其步骤是：

所述猕猴桃转化的方法包括下胚轴稳定转化和果实瞬时转化；所述下胚轴稳定转化的步骤如下：

S1、猕猴桃种子播种：将层积处理后的猕猴桃种子用75％酒精消毒1min，无菌水冲洗3次；然后用2％次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗3～5次；再将消毒后的猕猴桃种子播种于MS培养基中，放置于组培室中，待猕猴桃种子萌发生长；所述组培室中的温度为22～25℃，湿度为70％，光照周期为光照16h、黑暗8h；

S2、下胚轴去顶保湿：所述MS培养基中长出带有两片子叶的猕猴桃无菌苗后，用无菌手术刀在所述两片子叶的生长点下方切断，获得离体下胚轴；将所述离体下胚轴在培养箱中保湿预培养1～2d；

S3、遗传转化载体构建：构建35S：GUS(pRI101-GUS)过表达载体Ⅰ，通过无缝克隆技术将GUS基因序列构建植物表达载体pRI101上，35S启动子驱动其表达；