[发明专利]一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，其特征是：所述猕猴桃转化的方法包括下胚轴稳定转化和果实瞬时转化；所述下胚轴稳定转化的步骤如下：

S1、猕猴桃种子播种：将层积处理后的猕猴桃种子用75％酒精消毒1min，无菌水冲洗3次；然后用2％次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗3～5次；再将消毒后的猕猴桃种子播种于MS培养基中，放置于组培室中，待猕猴桃种子萌发生长；所述组培室中的温度为22～25℃，湿度为70％，光照周期为光照16h、黑暗8h；

S2、下胚轴去顶保湿：所述MS培养基中长出带有两片子叶的猕猴桃无菌苗后，用无菌手术刀在所述两片子叶的生长点下方切断，获得离体下胚轴；将所述离体下胚轴在培养箱中保湿预培养1～2d；

S3、遗传转化载体构建：构建35S：GUS过表达载体pRI101-GUS，通过无缝克隆技术将GUS基因序列构建植物表达载体pRI101上，35S启动子驱动其表达；

S4、农杆菌转化及侵染：通过所述35S：GUS过表达载体pRI101-GUS转化GV3101，获得转化成功的35S：GUS农杆菌Ⅰ；以GUS基因作为指示标记，验证下胚轴稳定转化体系；

将35S：GUS农杆菌Ⅰ菌液进行离心，分离掉上清液部分，然后将剩余部分重悬，得到侵染用的菌液浓度OD600值为0.8的农杆菌菌液Ⅰ；取2μL农杆菌菌液Ⅰ、6-BA和IBA添加在离体下胚轴的断面处，6-BA的浓度为0.8mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L；并继续保湿培养直至长出叶片，保湿培养的时间为1个月，期间重复2次侵染；

S5、转基因植株鉴定：提取步骤S4所述叶片的DNA和RNA，分别在基因组和转录水平进行鉴定；并将所述叶片进行GUS染色，在蛋白水平进行鉴定；

S6、稳定转化下胚轴体系建立：获得稳定转化的转化效率达到80％以上的猕猴桃。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，其特征是：步骤S2中，所述离体下胚轴在培养箱中保湿预培养的时间为1d。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的猕猴桃转化的方法，其特征是：所述果实瞬时转化的步骤是：

A.遗传转化载体构建：构建35S：GUS过表达载体pRI101-GUS；

B.农杆菌转化：通过所述35S：GUS过表达载体pRI101-GUS转化GV3101，获得转化成功的35S：GUS农杆菌Ⅱ；以GUS基因作为指示标记，验证果实瞬时转化体系；制备得到菌液浓度OD600值为0.4～1.0的农杆菌菌液Ⅱ；

C.农杆菌菌液转入猕猴桃果实：将步骤B所述的农杆菌菌液Ⅱ转入猕猴桃果实中，所述转入的方式为注射转入或抽真空转入，所述注射转入中注射果实菌液量为20μL、40μL或60μL；所述抽真空转入中的抽真空压强为0.06Mpa、0.08Mpa或者0.1Mpa、抽真空时间为2～5min；

D.瞬时转化果实体系建立：在28℃条件下放置3～5d，获得瞬时转化果实，通过GUS染色和酶活确定瞬时转化果实体系。