[发明专利]一种塔夫素及其变异体的检测方法

说明书

本发明提供了一种塔夫素及其变异体的检测方法，所述方法为高效液相色谱法，采用C18色谱柱；流动相A为0.03%七氟丁酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相A：B体积比为80~90:20~10；流动相流速为0.8~1.2ml/min，检测波长214nm，色谱柱温25~35℃，进样量5~20μl。本发明采用的高效液相色谱检测方法简单快速，能够准确的检测出样品中塔夫素及其变异体的存在，对含有塔夫素及其变异体产品的质量控制具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地涉及一种塔夫素及其变异体的检测方法。

背景技术

塔夫素(Tuftsin，TKPR)是脾脏分泌的具有促进白细胞吞噬和调节机体免疫应答作用的生物活性多肽。塔夫素能提升巨噬细胞的吞噬杀菌活性，对多形核白细胞有趋化作用，可提高天然杀伤细胞的细胞毒性作用；同时具有抗癌作用，于体外、体内均可抑制肿瘤细胞增殖。

虽然塔夫素天然变异体（TKP和TKPPR）的存在早就被大家所认识，例如文献“Tuftisn-的结构与功能”《国外医学临床生物化学与检验学分册》1990年11卷第6期13-16，已有报道；“反相-高效液相色谱法（RP-HPLC）测定血清tuftsin及其临床应用”《第三军医大学学报》1995年171卷第5期 445-447，也对塔夫素进行了检测，但是我们经过实验验证，该方法并不能区分塔夫素及其天然变异体TKPPR。

又有文献报道（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 9, pp.5702–5710），塔夫素天然变异体和塔夫素具有相同的生物活性，且塔夫素天然变异体TKPPR与受体结合的强度是塔夫素的4倍甚至更多，且至今未见文献报道生物体内塔夫素及其天然变异体的含量比例，这使得科学家们无法准确评价生物体内塔夫素的生物活性。

现有技术并没有关于塔夫素天然变异体在体内含量的检测，也没有关于塔夫素及其变异体在同一条件下区分、鉴定的检测。

塔夫素及其天然变异体TKPPR在结构上非常相似，仅有一个非极性氨基酸脯氨酸的区别，故其同为碱性氨基酸，所带电荷相同，极性相似。所以同时检测塔夫素及其天然变异体TKP、TKPPR三种成分具有较大的难度。目前尚未有文献报道对上述三种成分进行区分的检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，提供一种可快速检测塔夫素及其变异体的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种塔夫素及其变异体的检测方法，所述方法为高效液相色谱法，采用C18色谱柱；流动相A为0.03%七氟丁酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相A：B比例为（80~90）：（20~10）；流动相流速为0.8~1.2ml/min，检测波长214nm，色谱柱温25~35℃，进样量5~20μl。

进一步地，所述流动相A：B比例为90：10。

进一步地，所述流动相流速为1.0ml/min，检测波长214nm，色谱柱温30℃。

所述的检测方法，包括以下步骤：

S1.样品溶液配制：将待测试样品溶解于甲醇溶液中，样品与甲醇的质量体积比为1mg:1ml；

S2.对照品溶液配制：分别取塔夫素TKPR、变异体TKP和变异体TKPPR对照品溶解于甲醇溶液中，对照品与甲醇的质量体积比为1mg:1ml；

S3.检测：量取对照品溶液5μl注入色谱仪，记录色谱图；量取样品20μl，注入色谱仪，记录色谱图。

本发明获得的有益效果为：本发明采用的高效液相色谱检测方法简单快速，能够准确的检测出样品中塔夫素及其变异体的存在，对含有塔夫素及其变异体产品的质量控制具有重要意义。

附图说明