[发明专利]一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的方法

说明书

本发明涉及非洲猪瘟病毒技术领域，具体涉及一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA‑104细胞系感染滴度的方法。将非洲猪瘟病毒的D1133L基因片段插入慢病毒载体中，得到重组慢病毒载体，然后将重组慢病毒转染MA104细胞系，得到稳定表达D1133L基因的MA‑104细胞系MA‑104/D1133L，利用该细胞系接种非洲猪瘟病毒，可大大提高非洲猪瘟病毒滴度。感染ASFV后的MA‑104/D1133L可以多次收毒。本发明得到的MA‑104/D1133L细胞株与野生型MA‑104相比，ASFV病毒滴度显著提高。

技术领域

本发明涉及非洲猪瘟病毒技术领域，具体涉及一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的方法。

背景技术

非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）是一种双链DNA病毒，是唯一的虫媒DNA病毒，家猪和野猪感染后会引起出血性疾病。自2018年传入中国，对国内养猪业造成重大的经济损失。研究表明ASFV编码50多种结构蛋白和100多种非结构蛋白，其中ASFV编码五种解旋旋酶，分别为D1133L、Qp509L、Q706L、B962L和A859L，这些蛋白对病毒复制过程中的转录阶段发挥重要的功能。D1133L基因与牛痘病毒的D6R具有相似的结构域，与病毒转录起始相关。

猪肺泡巨噬细胞（PAM细胞）是非洲猪瘟病毒的靶细胞之一，但PAM细胞无法传代复制，通常获取PAM细胞是需从猪体内分离新鲜的肺获得，对于诊断实验室来说此操作过程耗时耗力，甚至有的诊断实验室不易获取PAM细胞。

MA-104属于非洲绿猴细胞，组织来源于肾细胞，属于可传达的上皮样细胞，MA-104细胞为商业化可以传代细胞系，可避免获取原代细胞节省时间。但MA-104细胞为非ASFV感染的靶细胞。申请人前期将ASFV感染MA-104细胞后，ASFV病毒滴度极低。

公开号为CN 103525773A的中国发明专利公开了一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其应用，该发明专利采用基因克隆方法从猪肺泡巨噬细胞克隆猪蓝耳病病毒受体蛋白基因编码片段，插入到真核表达载体，通过脂质体介导方式稳定转染到PRRSV敏感细胞，并采用极限稀释法，从单个阳性细胞克隆逐步扩繁，建立单个PRRSV 受体或多个PRRSV 受体遗传修饰的细胞系（株），利用该细胞接种猪蓝耳病病毒后，可以大幅提高病毒感染滴度，可以多次收毒，并最终确保所生产PRRSV 疫苗效力的稳定性。由此可以看出，该发明专利采用的仍然病毒的敏感细胞，其通过表达目标病毒的病毒受体来提高病毒感染滴度。

发明内容

本发明提出了一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系培养非洲猪瘟病毒时的病毒滴度，以进一步实现利用该可传代细胞系对非洲猪瘟病毒进行持续培养。

本发明的技术方案为：

一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的方法，将非洲猪瘟病毒的D1133L基因片段插入慢病毒载体中，得到重组慢病毒载体，然后将重组慢病毒转染MA104细胞系进行筛选，得到稳定表达D1133L基因的MA-104细胞系，利用该细胞系接种非洲猪瘟病毒，可显著提高非洲猪瘟病毒滴度。

具体操作步骤如下：

步骤1：重组慢病毒载体Lv-D1133L构建；

步骤2：包装慢病毒：

293T细胞消化，接种于10cm皿，包装慢病毒Lv-D1133L病毒液。终止感染，48小时后收集病毒液，利用0.45μm滤器过滤，然后对慢病毒Lv-D1133L进行病毒液浓缩，-80℃保存备用。

步骤3：慢病毒Lv-D1133L感染MA-104细胞，8小时后终止。

步骤4：筛选培养：利用3μg/mL的puromycin对各组细胞株进行药筛培养，48小时后更换培养基并传代，维持培养，收集各组细胞株，提取各组细胞RNA，进行qRT-PCR验证。筛选得到细胞株MA104/D1133L，D1133L在该细胞株中能够高效、稳定表达。