[发明专利]一种细胞色素P450突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种细胞色素P450突变体及其应用，涉及基因工程和生物酶催化技术领域；本发明以已报道的LG‑23作为突变模板，经过定点突变，改变酶与底物结合的活性口袋，得到一系列对石胆酸羟基化催化效果更高的突变体。在相同的催化条件下，本发明的突变体与模板LG‑23相比，对石胆酸7β羟基化生成熊去氧胆酸的活性提高可达21倍，特异性可达到99％。

技术领域

本发明涉及基因工程和生物酶催化技术领域，具体涉及一种细胞色素P450突变体及其应用。

背景技术

细胞色素P450酶(CYP450)是自然界中最具催化多样性的生物催化剂，参与多种物质的氧化反应，是人体内药物代谢过程中的关键酶。CYP450在水相温和的条件下可利用空气中的氧气进行饱和烷烃选择性羟基化，还可催化杂原子氧化，脱烷基化等一系列反应。CYP450共同的分子特征是含有一个亚铁血红素和一个完全保守的半胱氨酸，也是血红素铁的第五个配体。CYP450作为一种末端加氧酶，参与了生物体内的甾醇类激素合成等过程，在胆汁酸的合成过程中起到了重要的作用。CYP450由于其可自给自足、高电子耦合率以及广泛的底物谱而在P450酶中脱颖而出。

熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)，又名3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，最初是从熊胆汁中提取出来的一种具有多种生物活性的亲水性胆汁酸，被用作治疗各种肝胆疾病的重要药物，如通过降低胆汁中的胆固醇及胆固醇脂，逐渐溶解胆结石中的胆固醇而达到去除胆结石的目的。UDCA能增加胆汁的分泌，抑制疏水性胆酸的细胞毒作用，保护胆管细胞和肝细胞免受毒性胆汁损伤，改善肝胆病患者的发病率和死亡率,与鹅去氧胆酸等制剂相比也具有更好的耐受性和更高的安全性。

传统的UDCA合成工艺主要以胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)为原料，而石胆酸(LCA)是胆固醇的次级代谢物，有一定的生物活性和毒性，是胆汁酸提取过程得到的低值产品。以胆酸(CA)为原料通过化学合成制备UDCA需要经过七步反应(Hofmann,Lundgren,Theander,et al.The preparation of chenodeoxycholic acid and its glycine and taurineconjugates.Acta Chemica Scandinavica,1963,17:173-186.Giovannini,Grandini,Perrone,et al.7α-and12α-Hydroxysteroid dehydrogenases from Acinetobactercalcoaceticus lwoffii:anew integrated chemo-enzymatic route toursodeoxycholic acid.Steroids,2008,73(14):1385-1390.)，其具体合成路线如下所示：

在上述合成过程中，将C-12位羟基氧化需要用到三氧化铬，但三氧化铬是一种具有高毒性和致癌性的氧化剂，接着所用到的Woff-Kishner-黄鸣龙反应需要高温强碱条件才能实现向亚甲基的转化。上述合成路线条件苛刻、选择性差以及低回收率的问题也迫使研究人员找到更好的制备方法。