[发明专利]具有中和活性的人源性抗汉滩病毒（HTNV）Fab抗体及应用

说明书

一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒（HTNV）Fab抗体及应用，包括轻链和重链可变区和一个恒定区，用体外致敏法、EBV转化技术结合噬菌体展示技术建立人源性抗HTNVFab噬菌体抗体库，从中筛选出高亲和力并且具有中和活性的抗HTNVFab抗体四‑19。克隆该单克隆抗体轻链和重链可变区基因，获得该Fab抗体轻链和重链可变区基因序列和氨基酸序列，确认这些基因序列与蛋白序列的惟一性。可变区的氨基酸序列以及编码这些可变区的基因序列在后续构建用于HFRS的紧急预防和特异性治疗的高亲和力高中和活性的人源性抗体或疫苗方面有重要的潜在应用价值。

技术领域

本发明属于抗病毒感染技术领域，涉及一种抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体，具体涉及一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体及应用，以及具有中和活性的人源性抗HTNVFab抗体(四-19)的轻链和重链可变区。

背景技术

汉坦病毒感染引起的疾病在全球大部分地区均有发生，在我国主要流行的是由隶属于汉坦病毒属的汉滩病毒(HTNV)感染引起的肾综合征出血热(HFRS)，对于HFRS的预防，除了做好疫情监测，监测鼠密度，鼠带病毒率和易感人群，防鼠、灭鼠，控制传染源，切断传播途径，还要对易感人群接种HFRS疫苗。目前主要采用的是双价HTNV灭活疫苗。调查显示，基础免疫后，疫苗接种者血清抗体阳性率和水平均明显增高，说明产生了较好的免疫应答，但一年后，阳性率迅速降低，通过加强免疫，阳性率又得以回升。然而，虽然疫苗可起到较好的保护作用，但是由于疫苗加强针接种率低。HFRS患者以发热、出血、急性肾功能损伤为主要症状，目前尚无特异性药物治疗，通常采用对症治疗和并发症治疗，除了支持疗法，也在尝试针对HTNV感染特异的治疗方法。如Ⅲ期临床试验显示，由鼠源性中和抗体3D8和3G1组成的HFRS治疗性单抗具有显著的疗效。

虽然目前鼠源性抗体已广泛用于HFRS相关领域，如疾病诊断、病原学研究、流行病学调查及疾病治疗的初步尝试等。然而，临床实践显示，鼠源性单抗用于人体疾病治疗时受到很大的限制，来源于鼠的抗体对人有较强的免疫原性，导致人抗鼠抗体(humananti-mouseantibody，HAMA)应答，引起严重的变态反应，缩短治疗性单抗半衰期，使其疗效减弱，甚至可能危及患者的生命，限制了其临床应用。因此，制备人源性的单克隆抗体用于HFRS的紧急预防和治疗显得尤为重要。

抗体的重链(H链)和轻链(L链)包括氨基端(N)和羧基端(C)，靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位。抗体Fab段是由VL、CL和VH、CH结构域组成，只与单个抗原表位结合。抗体Fc段由CH结构域组成，与其他淋巴细胞表面Fc受体结合可引起相应的生物学效应。全人抗体因含有Fc段，可通过Fc段与细胞表面的Fc受体的结合，使病毒在细胞表面聚集，引起抗体依赖的增强效应(antibody dependent enhancement,ADE)，增强病毒对细胞的感染能力。目前，已建立多种方法生产小分子人源性抗体，其中用于人源性HTNV抗体制备的技术主要是噬菌体抗体库技术、转基因小鼠技术和单细胞PCR技术。噬菌体展示技术具有高特异性、高亲和性的特点，弥补了传统单克隆抗体制备繁琐、抗原性强、穿透力弱的缺点。并且噬菌体抗体库技术可在较短时间内可筛选出满足不同需要的抗体，但是由于库容量有限，筛选出的抗体亲和力多为中等强度。

因此，本发明通过构建大库容的抗HTNV噬菌体抗体库，筛选出具有中和活性的针对HTNV的人源性Fab抗体，具有分子量较小、穿透性强、易于到达病灶、免疫原性低和生产成本低等优点，在抗体治疗中具有不可替代的优势。本发明也为下一步筛选高亲和力的人源治疗性Fab抗体打下基础。

发明内容