[发明专利]一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用，涉及生物医学领域。本发明将Tet‑on系统应用于肝细胞，通过Tet‑on系统使得肝细胞的功能得到强化。Tet‑on系统具有高效率、精准、安全和可逆性的特点。进而由此制备了一种新型的永生化肝细胞，该肝细胞可以通过添加或去除四环素类似物实现肝细胞功能的可逆调控，促进肝细胞功能的可逆增强。该制备方法简单易行，培养成本低，种子细胞来源于永生化肝细胞，易于临床转化。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用。

背景技术

合适的肝细胞系在生物人工肝技术、药理毒理学研究和肝脏组织工程研究中的地位越来越重要。理想的肝细胞源应具备完整的肝功能、良好的增殖能力以及无致瘤、无感染的风险。目前常用的肝细胞源有原代人肝细胞、原代猪肝细胞、人肝癌细胞系HepG2、HepaRG、永生化细胞以及干细胞分化肝细胞等。这些类肝细胞在体外虽然具有一定的肝功能，但是它们各自存在着成熟度不足、有限性扩增、功能不稳定、异种移植排斥、生物安全性不高和致瘤风险等应用障碍。

公开号为CN110438157B和公开号为CN105521482A的中国发明专利申请公开了，单独或联合应用不同的肝细胞特异性转录因子来进一步诱导类肝细胞分化的方法，但这些方法或种子细胞来源于肝癌细胞，或使用的培养体系成本高昂，皆难以进行临床转化。

公开号为CN105925609B和公开号为CN107557389A的中国发明专利申请公开了，通过可控诱导不同的目的外源基因过表达，来调控干细胞向不同的体细胞分化的方法。前者促进多能干细胞向造血细胞分化，后者则促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用以解决上述技术问题。

发明人将Tet-on系统应用于肝细胞，通过改进Tet-on系统使得肝细胞的功能得到强化。进而由此制备了一种新型的永生化肝细胞，该肝细胞可以通过添加或去除四环素类似物实现肝细胞功能的可逆调控，促进肝细胞可逆功能的增强。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法，将包装后的含调控肝细胞转录的Tet-on系统的慢病毒感染人永生化肝细胞，然后利用筛选剂和扩增培养基对经病毒转染后得到的细胞进行抗性筛选和扩增传代培养，得到肝功能强化可逆的永生化肝细胞系；通过添加四环素类似物使得永生化肝细胞系呈肝向功能强化状态，通过去除四环素类似物使得永生化肝细胞系呈正常肝细胞增殖状态；

调控肝细胞转录的Tet-on系统包括调节表达盒和反应表达盒，调节表达盒包括肝脏特异性启动子和反义四环素激活子，反应表达盒包括四环素诱导型启动子和转录因子编码基因；转录因子编码基因包括但不限于FOXA3基因、CEBPA基因和GATA6基因。

本发明提供的肝功能可逆的永生化肝细胞的制备方法具有高效率、精准、安全和可逆性的特点。

高效率体现在：无诱导时目的基因表达水平较低，有四环素类似物诱导存在时，目的基因表达。目的基因包括转录因子编码基因和筛选基因。具体表现为：四环素类似物不存在时，反义四环素激活子无法与TRE结合。由于反应表达盒缺少增强子，反义四环素激活子（reverse tetracycline tranional activator，rtTA）未与TRE结合时，四环素诱导型启动子无法启动目的基因的表达，从而表现为基因表达受抑制。四环素类似物存在时，反义四环素激活子能够与TRE结合，从而使得四环素诱导型启动子活化，从而使得目的基因表达。

精准调控体现为可以通过控制四环素类似物的剂量及用药时间进行肝细胞功能强化的可逆调控。