[发明专利]干预肌萎缩纤维类型改变的基因位点

说明书

本发明为干预肌萎缩纤维类型改变的基因位点，分别在人和鼠的骨骼肌纤维亚型MHC‑IIb启动子区域中都发现了调控活性的功能控制区，分别为新的高度保守序列模体。该序列模体的发现，为MHC‑IIb的改造提供了新的可突变位点。通过对该可突变位点的碱基进行替换，可以逆转该基因的转录激活效应。此外，该功能控制区中任一基因位点及突变体均有助于研制干预骨骼肌肌纤维类型转变的制剂，为发现新的防治肌萎缩药物奠定基础。

技术领域：

本发明涉及生物领域，具体涉及干预肌萎缩纤维类型改变的基因位点。

背景技术：

真核生物在长期的进化过程中，部分被保留下来的保守性序列往往是调控基因转录的关键位点。筛选并鉴定出这些保守性位点对于实现关键基因的精准调控至关重要。

骨骼肌在肌萎缩形成过程中，肌纤维类型以有氧代谢为主的纤维亚型逐渐转变为以无氧酵解为主的纤维亚型，是废用性肌萎缩的特征性改变之一，也是引起肌肉萎缩后运动耐力下降的直接因素。MHC-IIb是骨骼肌纤维四种亚型中之一，为快收缩性肌纤维，以无氧酵解为主要供能方式，收缩速率较快，但容易疲劳。

研究表明，在废用性肌萎缩形成过程中，以肌纤维亚型MHC-IIa下降幅度以及MHC-IIb的增加幅度最为显著。因此逆转或阻断MHC-IIb增加，可以作为缓解肌萎缩及其运动耐力下降的一种有效策略。

如果能筛选并鉴定出在肌萎缩形成过程中，MHC-IIb基因启动子区域有功能活性的保守性位点，就可以通过对该位点突变和改造，实现对MHC-IIb基因的精准调控，逆转或阻断MHC-IIb增加，缓解肌萎缩的形成并且改善肌肉生理功能。

发明内容：

本发明的目的是发现干预肌萎缩纤维类型改变的基因位点，具体目标是在MHC-IIb基因中筛选出调控活性的功能控制区，通过突变该位点部分碱基，逆转外界刺激对于该基因的转录抑制效应。

本发明分别在人和鼠的骨骼肌纤维亚型MHC-IIb启动子区域中都发现了调控活性的功能控制区，分别为以下新的高度保守序列模体：在小鼠中的碱基序列为AGACtccgt，在人基因组中的碱基序列为AGACtcctt。

具体操作过程是，利用生物信息学手段，通过对多物种MHC-IIb基因启动子区域序列进行比对，首先筛选到该基因启动子区域存在多个保守结合位点，通过染色质免疫共沉淀实验证实，距离转录起始位点最近的保守位点可以和转录因子Smad相结合，该位点位于人类MHC-IIb基因上游-408～-400区域，碱基序列为AGACtcctt；位于小鼠MHC-IIb基因上游-630～-622区域，碱基序列为AGACtccgt。人和小鼠序列共有的核心关键位点为AGAC。在此基础上利用小鼠基因组序列为基础完成了本发明。

在构建携带有该基因启动子保守位点的野生型报告载体基础上，利用点突变试剂盒将保守碱基序列的关键核心位点由AGAC突变为TTTT，体内转染后证实，Smad对MHC-IIb基因的转录激活效应消失，证实该位点具备转录调控功能。

本发明的碱基序列是DNA形式，为功能调控区域，不具备编码mRNA进而翻译成多肽信息的功能，DNA可以是单链的或是双链的。该发明还涉及该位点的多个碱基突变体，理论上，对于该序列位点的单点或多点突变均可以减弱或完全阻断该位点的功能活性。

本发明MHC-IIb基因转录调控位点通常可以用PCR扩增法或碱基合成的方法获得。

一旦获得了有关的序列，就可用重组载体将该序列转染至宿主细胞，增加该序列在原始宿主的拷贝数，增强该基因的转录激活作用；或者突变该序列，沉默或阻断外界刺激或上游转录因子对该基因的转录激活作用。

本领域一般技术人员清楚，通过碱基点突变试剂盒，可针对本发明提供的保守位点序列，突变并同源重组宿主细胞MHC-IIb基因的启动子位点；或者以此位点设计互补核苷酸序列，对该位点的封闭阻断，实现对MHC-IIb基因的转录调控。