[发明专利]一种青海湖裸鲤肌肉细胞系构建方法

说明书

本发明公开了一种青海湖裸鲤肌肉细胞系构建方法，包括原代培养、传代培养、细胞冻存与复苏，所述原代培养的细胞培养液的组分包括：基础培养基、10～30％牛血清、200～400IU/mL青霉素、200～400μg/mL链霉素、1～5mmol/L谷氨酰胺和1～5mmol/L mmol/L丙酮酸钠；所述传代培养的细胞培养液的组分包括：基础培养基、10～30％牛血清、50～250IU/mL青霉素、50～250μg/mL链霉素、1～5mmol/L谷氨酰胺和1～5mmol/L mmol/L丙酮酸钠；所述细胞冻存的冻存液组分包括：基础培养基、10～30％牛血清、50～250IU/mL青霉素、50～250μg/mL链霉素、5～30％DMSO、1～5mmol/L谷氨酰胺和1～5mmol/L mmol/L丙酮酸钠。本发明的制备方法简单，无需特殊设备，在一般的无菌培养室内均可操作，制备得到的细胞生长良好、稳定，可用于营养、免疫、环境毒性、基因功能分析等研究。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种青海湖裸鲤肌肉细胞系构建方法。

背景技术

青海湖裸鲤(Gymnocyprisprzewalskii)，俗称湟鱼，属鲤形目(CyPriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，裂腹鱼亚科，裸鲤属，主要分布于中国青海湖及其湖周支流，为高原低温盐碱性水域经济鱼类，是青海湖中唯一的经济鱼类，也是我国重要的经济鱼类之一。其喜栖息于滩边、大石堆间流水缓慢处、深潭或岩缝中，适应性强，在半咸水(青海湖水含盐量12～13‰)或淡水中均可生活。在自然条件下，青海湖裸鲤的生长极为缓慢，生长到300～500g平均需要7～10年的时间。自20世纪60年代开始，青海湖周围几十万亩草原被开垦为农田，流入青海湖的108条河流被人为拦河筑坝，阻塞繁殖通道，许多河流干涸断流，致使裸鲤无法到淡水中产卵，造成大量裸鲤在河口地带死亡。有关资料表明，青海湖现有裸鲤资源量约为7500吨，不足开发初期的1/10，而目前，鸟岛栖息的鸟类每年要吞食近千吨的裸鲤，加上近年来由于裸鲤的生存环境受到污染、破坏和过度捕捞等原因，造成青海湖裸鲤资源量严重下降，渔业资源破坏严重，同时，伴随着青海湖盐度的逐年升高，青海湖裸鲤资源保护面临着重要的挑战。

为保护青海湖裸鲤资源，青海湖裸鲤人工增殖放流技术在过去的二十余年里已经逐渐成熟，该技术需要自然条件下成熟的青海湖裸鲤亲本作为性细胞来源，用于人工授精和仔鱼孵化养殖，该技术需要在特定时间段进行。养殖青海湖裸鲤的人工繁育技术还未建立，目前还未见有全人工繁育青海湖裸鲤群体的相关报道，因此，在对青海湖裸鲤进行自然适应、进化、疾病等研究时，通常需要大量的青海湖裸鲤个体，获取青海湖裸鲤个体的来源只能依靠捕获野生个体进行，这与保护该珍稀鱼类种质资源形成了亟待解决的矛盾。

建立青海湖裸鲤鱼类细胞系作为细胞模型，是解决以上问题的重要方法。鱼类细胞培养起于20世纪60年代，发展至今已建立了280余株细胞系，中国的鱼类细胞培养历经30多年，只建立了50余株细胞系，建立细胞系的物种不足中国鱼类总数的1.5％(中国鱼类超过3500种)，由此可见，细胞系的构建速度是非常缓慢的，本身存在一定的困难。且相较于其他鱼类细胞培养，由于自然条件下的青海湖裸鲤个体通常为患病个体，携带多种寄生虫，在细胞培养中更易发生污染，细胞致死率较高，导致失败率上升。因此，目前亟需建立一种细胞致死率低、能获得大量的肌肉细胞，用于探究青海湖裸鲤生长的基础研究的细胞系构建方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青海湖裸鲤肌肉细胞系构建方法，能够获得大量的肌肉细胞，用于探究鱼类生长的基础研究。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种青海湖裸鲤肌肉细胞系构建方法，包括原代培养、传代培养、细胞冻存与复苏，所述原代培养的细胞培养液的组分包括：基础培养基、10～30％牛血清、200～400IU/mL青霉素、200～400μg/mL链霉素；

所述传代培养的细胞培养液的组分包括：基础培养基、10～30％牛血清、50～250IU/mL青霉素、50～250μg/mL链霉素；