[发明专利]用于记录样本中单个粒子的轨迹的方法和显微镜

说明书

本发明涉及一种记录样本中单个粒子的运动轨迹的方法和执行该方法的光学显微镜。从至少近似已知的起始位置开始，用扫描光的具有局部强度最小值的强度分布来扫描粒子。当用扫描光照射时，待跟踪的粒子产生可探测的光信号，根据光信号的强度计算出粒子的更新坐标。根据本发明，当并行探测的第二测量变量满足中止标准时，终止扫描。

发明的技术领域

本发明涉及根据MINFLUX原理对样本中单个粒子进行时间上跟踪的方法。本发明还涉及执行该方法的光学显微镜。

现有技术

对样本中单个粒子的观测和跟踪(英文：Single Particle Tracking,SPT—单粒子追踪)是研究生物系统中分子动力学的一项重要技术。为此，可以使用光散射粒子，例如金属纳米粒子；然而，通常使用荧光粒子或荧光染料的单个分子。有了荧光染料，还可以标记原本无法探测到的粒子，从而使其可用于粒子跟踪。生物应用领域包括酶催化反应、DNA转录、离子通道的活性和囊泡转运的研究。

在此，所用方法的适用性在很大程度上取决于可实现的观测时段和观测单个粒子时的时间分辨率。为此，一方面是基于显微镜的成像方法，另一方面是基于点探测器的方法，这些在现有技术中都是已知的。前者允许在更大的图像范围内观测单个粒子，从而可以在相对较长的时段内跟踪自由扩散的粒子。然而，可实现的时间分辨率受到相机帧速率的限制，这就是为什么用这种方法不可能研究快速过程。

相反，用基于点探测器的方法，特别是在使用时间分辨的单光子计数时，可以实现小到皮秒范围的高时间分辨，然而在许多应用中，观测时段仅限于单个粒子在照射光焦点中的停留时间。如果粒子可以自由扩散，则观测时段就特别短。为了克服这种限制，待跟踪的粒子、特别是单分子，往往被固定住，即绑定在固定的载体上或借助于光学镊子保持在一个地方。然而，为了使用光学镊子，单个生物分子必须与(较大的)载体粒子耦合，这严重限制了在天然生命系统中的应用。

可替代地，借助于可调节的样本保持器和闭环调节主动将分子保持在焦点中这种方式，可以延长使用单点探测器对单个粒子的观测时段。N.P.Wells等人在Nano Lett.10,4732(2010)发表的“Time Resolved 3DMolecular Tracking in Live Cells”中首次实现了对单个荧光分子的跟踪，其中在92％的甘油(即非常粘稠的介质)中的Cy5-dUTP分子可以被实时跟踪约100ms。由于染料分子在粘度较小的介质中的扩散速度明显较高，使得单个染料分子不能再被足够快速地跟踪，并且快速地离开用于样本跟踪的调节装置的捕获范围，因此在该文章中使用的基于压电的调节器无法在粘度较小的(并因此与实践更相关的)介质中应用该方法。轨迹的最大时间长度也很短，约为100ms，这特别是由于光子预算有限，即染料分子在最终被漂白之前发出的荧光光子数量有限。

为了更快地跟踪单个粒子，特别是单个染料分子，现在有了快速光束偏转装置，特别是电光偏转器或声光偏转器，它们的定位时间达到了(亚)微秒范围，但定位范围仅限于几微米。为了能够在样本的更大范围内扫描单个粒子，这些快速非机械的扫描装置可以与振镜结合，振镜允许在样本的更大范围内对聚焦激发光进行(较慢的)预定位。

文献DE 10 2011 055 367 A1描述了一种以缩写MINFLUX著称的单粒子跟踪的变型，其中，用扫描光的具有强度最小值的光分布来照射粒子，并记录由粒子发射的光子。通过使强度分布相对于样本偏移，使粒子发射的光子速率保持最小，从而追踪到在样本中移动的粒子的最小值。随着定位置信度的增加，强度最小值的位置可以越来越靠近被跟踪的粒子周围，并且增加了扫描光的功率，由此实现了进一步精确的定位。