[发明专利]用于编辑真核细胞的内源DNA的融合蛋白

权利要求书

1.蛋白，用于在真核细胞或真核生物体中在内源DNA的靶位点处编辑所述内源DNA，所述蛋白包含位点特异性核酸内切酶和5’-3’核酸外切酶，其中所述5’-3’核酸外切酶优选地是单体的5’-3’核酸外切酶。

2.根据权利要求1所述的蛋白，其中5’-3’核酸外切酶是氨基酸序列为以下或氨基酸序列包含以下的蛋白：

A)

(i)SEQ ID NO：43(PapE)中定义的氨基酸序列，或

(ii)与SEQ ID NO：43中定义的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或

(iii)与SEQ ID NO：43中定义的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列，或

(iv)与SEQ ID NO：43中定义的氨基酸序列相比具有1至121个氨基酸取代、添加、插入和/或缺失的氨基酸序列，或

B)

(i)SEQ ID NO：44(PiE)中定义的氨基酸序列，或

(ii)与SEQ ID NO：44中定义的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或

(iii)与SEQ ID NO：44中定义的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列，或

(iv)与SEQ ID NO：44中定义的氨基酸序列相比具有1至131个氨基酸取代、添加、插入和/或缺失的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述5’-3’核酸外切酶是氨基酸序列为以下或氨基酸序列包含以下的蛋白：

C)

(i)SEQ ID NO：45(ME15)中定义的氨基酸序列，或

(ii)与SEQ ID NO：45中定义的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或

(iii)与SEQ ID NO：45中定义的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列，或

(iv)与SEQ ID NO：45中定义的氨基酸序列相比具有1至60个氨基酸取代、添加、插入和/或缺失的氨基酸序列；或

D)

(i)SEQ ID NO：46(SpiPh)中定义的氨基酸序列，或

(ii)与SEQ ID NO：46中定义的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或

(iii)与SEQ ID NO：46中定义的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列，或

(iv)与SEQ ID NO：46中定义的氨基酸序列相比具有1至59个氨基酸取代、添加、插入和/或缺失的氨基酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是包含所述位点特异性核酸内切酶和所述5’-3’核酸外切酶的融合蛋白。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是包含第一蛋白亚基和第二蛋白亚基的寡聚蛋白(蛋白复合物)，所述第一蛋白亚基包含所述位点特异性核酸内切酶，所述第二蛋白亚基包含所述5’-3’核酸外切酶。

6.根据权利要求5所述的蛋白，其中所述第一蛋白亚基包含(优选地作为所述第一蛋白亚基的结构域的)所述位点特异性核酸内切酶和第一相互作用结构域，所述第二蛋白亚基包含(优选地作为所述第二蛋白亚基的结构域的)所述5’-3’核酸外切酶和第二相互作用结构域，其中所述第一相互作用结构域和所述第二相互作用结构域彼此结合以形成所述寡聚蛋白(蛋白复合物)。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是包含第一蛋白亚基和第二蛋白亚基和核酸(如gRNA)和适体的寡聚蛋白，所述第一亚基包含所述核酸内切酶，所述第二亚基包含所述5’-3’核酸外切酶，所述核酸具有能够结合所述核酸内切酶的部分，所述适体能够结合所述5’-3’核酸外切酶。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白，其中所述位点特异性核酸内切酶是能够诱导DNA双链断裂或DNA内的双链断裂的CRISPR核酸酶，例如Cas9或Cas12a，或是能够诱导双链DNA的单链切口的具有切口酶活性的CRISPR核酸酶，例如Cas9的切口酶变体。