[发明专利]体液样品中结核的检测方法

说明书

描述了用于检测体液样品中TB的方法和系统。通过从体液样品中提取细胞外囊泡(EVs)并使用抗体缀合纳米颗粒来捕获Mtb相关的生物标志物，结果表明该测试可以在数小时内而不是数周内完成，并且可以以高精度显著降低检测限。此外，本发明的方法和系统可以区分活动性的和潜伏性的TB感染。

在先相关申请

本申请要求2020年8月5日提交的美国临时申请号63/061,674的优先权，其出于所有目的通过引用整体并入本文。

联邦赞助的研究声明

不适用。

本发明领域

本发明总体上涉及一种用于诊断体液样品中结核的方法，并且更具体地涉及一种通过使用暗视野显微术的纳米等离子体增强测定法来检测体液样品中循环细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)上结核衍生抗原的方法。

本发明背景

全球结核病成为比早期估计更严重的负担，因为每年有潜在的数百万人既没有确诊又没有报告。结核病的及时诊断对于患者的积极预后仍然是迫切的。然而，诸如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)培养和痰涂片等传统技术耗时且灵敏度低。Xpert MTB/RIF试验能够在2小时内快速诊断结核并评估利福平耐药性，然而该试验的灵敏度依赖于痰液样品的高细菌负载。尽管在探索结核病原体衍生抗原标记物方面付出了巨大努力，世界卫生组织仅审核了脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)，一种经鉴定可在活动性结核病期间流入尿液的结核抗原，可用于快速早期筛查HIV阳性的结核病患者。然而，未能在HIV阴性患者的尿液中检测到LAM限制了这些试验的适用性，因为85％的结核病患者为HIV阴性。此外，该试验仅适用于尿液样品。

理想的侵入性检测应同时测量体液中的致病靶标和宿主靶标，以在不同阶段(包括潜伏感染)实现对结核病检测的最高准确度。与致病过程密切相关的细胞外囊泡(EVs)可包含用于标记物发现的许多宿主和成分。作为一种被广泛研究和公认的结核病特异性标记物，在HIV阴性患者中检测LAM的失败可能是由于LAM被免疫复合物的形成所掩盖。LAM已被充分证实可介导EVs从巨噬细胞释放。

因此，需要开发一种能够快速、定量、超灵敏、非基于痰液的生物标志物的检测活动性结核病的检测方法。

本发明概述

在本发明的一个方面，描述了一种检测体液样品中结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)特异性蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提取体液样品中的细胞外囊泡(EVs)；(b)将抗体缀合纳米颗粒与步骤(a)中的EVs混合，其中所述抗体缀合纳米颗粒与抗MTB特异性蛋白的第一抗体缀合；和(c)使用暗视野显微术检测所述MTB特异性蛋白的存在。

在本发明的另一方面，描述了一种用于检测体液样品中MTB特异性蛋白的系统。所述系统包括：(a)暗视野显微镜；(b)样品基质；和(c)抗体缀合纳米颗粒，其中所述抗体缀合纳米颗粒与靶向MTB特异性蛋白的第一抗体缀合；其中所述样品基片包被有抗细胞外囊泡特异性(EV特异性)蛋白的第二抗体。

在本发明的另一方面，描述了一种通过检测体液样品中第一和第二结核分枝杆菌(MTB)特异性蛋白的存在来检测和确定结核感染状态的方法。所述方法包括以下步骤：a)提取体液样品中的细胞外囊泡(EVs)；b)将抗体缀合纳米颗粒与步骤(a)中提取的EVs混合，其中所述抗体缀合纳米颗粒与抗第一MTB特异性蛋白的第一抗体和抗第二MTB特异性蛋白的第二抗体缀合；c)使用暗视野显微术检测所述第一和/或第二MTB特异性蛋白的存在；和d)基于所述第一和第二MTB特异性蛋白的存在来确定结核感染状态。