[发明专利]抑制人半乳凝素-1的DNA适配体、方法以及治疗有需要的哺乳动物的方法

说明书

本发明涉及DNA适配体，除了在几种人实体肿瘤细胞系中呈现抗增殖作用之外，其以非常高的结合亲和力和特异性识别人半乳凝素‑1即hGal1，并抑制hGal1诱导的血凝作用。这些DNA适配体是使用修饰的SELEX方案从合成适配体库中鉴定和选择的。采用DNA序列、热交换测定、荧光光谱法对这类适配体进行表征，并通过血凝抑制测定和通过癌细胞系增殖测定对其生物学功能进行评价。细胞毒性测试表明，在测试的41个序列中，其中四个序列(SEQ ID NO.04，SEQ ID NO.09、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12)具有抑制肿瘤细胞的细胞生长的最佳能力，但是所有序列都是有功能的。另外，本发明开发的适配体将用于例如治疗与哺乳动物中人半乳凝素‑1与配体结合有关的疾病，其中所述疾病选自炎症、纤维化、脓毒性休克、癌症、自身免疫性疾病、代谢紊乱、心脏病、心力衰竭、病理性血管生成和眼部疾病，主要是癌症。

发明领域

本发明涉及医学领域，更准确地说，涉及核酸领域，并描述了DNA适配体，除了在肿瘤细胞系中呈现抗增殖作用之外，其以非常高的结合亲和力和特异性识别人半乳凝素-1(hGal1)，并抑制hGal1诱导的血凝作用。本发明开发的适配体将用于治疗与哺乳动物中人半乳凝素-1与配体结合有关的疾病，其中所述疾病选自炎症、纤维化、脓毒性休克、癌症、自身免疫性疾病、代谢紊乱、心脏病、心力衰竭、病理性血管生成和眼部疾病，主要是癌症。

发明背景

半乳凝素是聚糖结合蛋白，其优选与O和N-连接多糖中遇到的β-半乳糖苷碳水化合物相互作用。半乳凝素结合活性通常是由于其在碳水化合物识别结构域(CRD)中的位点在进化上是保守的。人半乳凝素-1(hGal1)含有约15kDa的单一CRD，其可以同源二聚化，从而增加结合价。它是研究较好的半乳凝素之一，其生理作用已知参与血管生成、白细胞稳态和存活、调节包括病原体防御的宿主免疫反应、生育能力、炎症和自身免疫性疾病。例如，hGal1功能在癌症生物学中引起了极大的兴趣，因为据报道它在不同类型的肿瘤细胞中上调，并促进参与恶性细胞过程的多个事件的多价蛋白质-碳水化合物相互作用。此外，hGal1被描述为抗肿瘤免疫反应抑制剂，作为肿瘤血管生成诱导剂和作为肿瘤转移过程的促进剂。由于这些参与肿瘤发展的活动，半乳凝素-1被认为是抗癌治疗的有希望的靶标，并且在开发用于治疗和诊断应用的创新半乳凝素-1结合分子方面进行了持续努力。

最近，一些技术进步使得体外进化方法的改进成为可能，以鉴定与这些靶标结合的非生物寡核苷酸。这种用于选择功能性核酸的寡核苷酸体外进化方法称为SELEX，并且该技术产生的新类别的短单链寡核苷酸配体称为适配体。

本文所用的术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或其修饰形式，及其类似物。核苷酸包括这样的物质，其包括嘌呤(例如腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及其衍生物和类似物)以及嘧啶(例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和类似物)。当碱基标示为“A”、“C”、“G”、“U”或“T”时，它旨在包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，及其修饰形式和类似物。

如本文所用，“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换地用于指代核苷酸的聚合物，并且包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体和修饰这些种类的核酸、寡核苷酸和多核苷酸，其中各种实体或部分附接到核苷酸单元的任何位置都包括在内。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括双链或单链分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸是比术语适配体的更宽泛的术语，因此，术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括作为适配体的核苷酸的聚合物，但术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸不限于适配体。

适配体是一类单独的分子，以类似的抗体方式，能够被制作成与许多不同的靶标结合，因此，作为疾病诊断和治疗中的研究工具是有用的。此外，它们大大优于其竞争者，例如单克隆抗体和其他类型的分子，因为它们除了是合成的之外，还具有比其他技术更高程度的亲和力和特异性，因此具有更快、更便宜的工艺。