[发明专利]一种适应猪流行性腹泻病毒的ST悬浮细胞株ST-J及其应用

说明书

本发明公开了一种适应猪流行性腹泻病毒的ST悬浮细胞株ST‑J及其应用，属于生物技术领域。本发明提供的ST‑J悬浮株能够稳定传代生长，利用其进行PEDV的悬浮培养时，培养的PEDV能够稳定增殖，并且可以用于连续增殖培养PEDV并多次收获病毒培养液，可以节约大量的生产成本和培养时间，提升产能。利用获得的病毒培养液制备得到的灭活疫苗免疫原性好，且稳定安全，能够有效用于预防猪流行性腹泻疾病。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适应猪流行性腹泻病毒的ST悬浮细胞株(命名为ST-J)及其应用，尤其涉及在培养猪流行性腹泻病毒以及生产猪流行性腹泻病毒灭活疫苗中的应用。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病，并且各年龄段的猪对PEDV均易感，对养猪业造成严重的经济损失。

目前猪流行性腹泻病一般采取疫苗接种进行预防，国内多用Vero-E6细胞(非洲绿猴肾细胞)或ST细胞(猪睾丸细胞)贴壁或悬浮培养增殖猪流行性腹泻病毒，以生产预防猪流行性腹泻疾病的灭活疫苗。例如专利文献CN107412763A(以下称文献1)公开一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法，其中采用ST细胞对PEDV进行增殖培养，但其采用的是传统贴壁培养的方法对PEDV进行增殖培养，在扩大繁殖过程中需要利用细胞转瓶、细胞工厂等，耗费较多的人力与财力；并且在病毒培养过程中需要进行换液操作，工艺繁琐。现有的悬浮培养方法中，专利文献CN111035756A(以下称文献2)虽然公开一种适用于无血清悬浮培养猪流行性腹泻病毒的ST细胞株，但是用其培养PEDV的时间为24-30h收获病毒液时的细胞活率低于20％，因此该ST细胞株不适用于连续增殖培养PEDV，不利于提升产能。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明提供一种ST悬浮细胞株，命名为ST-J悬浮株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202150，保藏日期为2021年1月29日。

在一些实施方式中，在用上述的ST-J悬浮株CCTCC NO：C202150培养猪流行性腹泻病毒收获的病毒培养液中，病毒的滴度为6.00TCID₅₀/0.1ml以上，可选为6.50TCID₅₀/0.1ml以上，且ST-J细胞的活率为28％以上，可选为28.12％-71.70％。

本发明另一方面提供一种利用ST-J悬浮株CCTCC NO：C202150培养猪流行性腹泻病毒的方法，其包括以下步骤：

S1：将ST-J悬浮株在营养液中扩大培养，获得细胞悬液；

S2：向步骤S1的细胞悬液中加入等体积的病毒维持液，随后加入EDTA-胰酶，并接种猪流行性腹泻病毒种毒，培养；

S3：收获病毒培养液。

在一些实施方式中，步骤S1中所述扩大培养为至细胞浓度为(4.0-6.0)×10⁶细胞/mL，细胞活率达95.0％以上。

在一些实施方式中，步骤S1中所述营养液为CD ST 258营养液。

在一些实施方式中，步骤S2中所述病毒维持液为DMEM和/或CD ST 239。

在一些实施方式中，步骤S2中所述EDTA-胰酶的加入量为使其终浓度为5-25μg/ml。

在一些实施方式中，步骤S2中所述猪流行性腹泻病毒种毒的接种量为1.0％-5.0％。

在一些实施方式中，步骤S1中使用摇瓶进行扩所述大培养，扩大培养的条件为：35.0℃-37.0℃，5.0％CO₂，100rpm/min-130rpm/min摇床培养48-72h。