[发明专利]羊膜上皮细胞培养方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊膜上皮细胞培养方法，包括以下步骤：S1、羊膜组织提取；S2、用镊子去掉羊膜组织上的血块和杂物，清理干净的羊膜放入一个新的50mL离心管、加入胰酶，没过羊膜，上下颠倒消化清洗；S3、第一次胰酶消化；S4、第二次胰酶消化；S5、原代培养：①去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(0.93×10⁸cells)，接种浓度为2×10⁶个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数5％CO₂的饱和湿度的培养箱中进行原代培养；②培养到第3天换液，随后每隔2天换液1次，直至细胞密度达到80％‑90％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊膜上皮细胞培养方法。

背景技术

人羊膜上皮细胞是来源于胎盘的羊膜组织的上皮层，人羊膜上皮细胞具有未分化的胚胎干细胞特性，能表达所有胚胎干细胞的分子标志物，具有向三个胚层组织分化潜能。且因其缺乏端粒酶，而规避了移植后的致瘤风险。人羊膜上皮细胞还不表达HLA抗原，移植后无免疫排斥反应，具有优良的移植免疫耐受特点，且能分泌多种免疫抑制因子和炎症抑制因子，抑制宿主T细胞免疫应答和炎性反应，避免了移植后的免疫排斥与炎症发生。因此，人羊膜上皮细胞是干细胞与再生医学领域的理想种子细胞新资源。

发明内容

本发明的目的，是为了解决背景技术中的问题，提供羊膜上皮细胞培养方法。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

羊膜上皮细胞培养方法，包括以下步骤：

S1、羊膜组织提取；

S2、用镊子去掉羊膜组织上的血块和杂物，清理干净的羊膜放入一个新的 50mL离心管、加入胰酶，没过羊膜，上下颠倒消化清洗；

S3、第一次胰酶消化：①用长镊子捞出羊膜放入玻璃烧杯，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃搅拌消化10min；②长镊子捞出羊膜放入另一玻璃烧杯，弃掉上步骤中的剩余液体，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃搅拌消化30min；③长镊子捞出羊膜放入另一玻璃烧杯，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃继续搅拌消化30min；剩余液体平均分装入6个离心管中，每管加入终止液，细胞筛过滤后4℃，200×g，离心10min；④去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(1.3× 10⁸cells)，接种浓度为2×10⁶个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数 5％CO2的饱和湿度的培养箱中进行原代培养；

S4、第二次胰酶消化：①从步骤S6中捞出的羊膜加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃继续搅拌消化30min，捞出并弃掉羊膜；②剩余液体平均分装入6个离心管中，每管加入终止液至45mL，细胞筛过滤后4℃，200×g，离心10min；

S5、原代培养：①去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(0.93×10⁸cells)，接种浓度为2×10⁶个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数5％CO₂的饱和湿度的培养箱中进行原代培养；②培养到第3天换液，随后每隔2天换液1 次，直至细胞密度达到80％-90％。

作为优选，所述步骤S1中羊膜组织提取的具体步骤为：1、点燃酒精灯，准备好无菌的镊子剪刀、托盘、手套；2、往2个玻璃烧杯中分别倒入生理盐水，带上无菌手套，从采集袋中取出胎盘；3、用一把镊子和剪刀辅助，从胎盘上撕下羊膜；4、放入装有生理盐水的玻璃烧杯中清洗，捞出，放入另一装有生理盐水的玻璃烧杯中再次清洗；5、用长镊子将羊膜拎起，用剪刀剪成5cm左右的小段，放入培养皿中。

作为优选，所述步骤S2-S4中胰酶浓度为0.05％。

综上所述，本发明通过羊膜组织获得羊膜上皮细胞，并将其成功分离培养，培养过程相对容易操作，细胞存活率高。

附图说明