[发明专利]羊膜上皮细胞培养方法

权利要求书

1.羊膜上皮细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、羊膜组织提取；

S2、用镊子去掉羊膜组织上的血块和杂物，清理干净的羊膜放入一个新的50mL离心管、加入胰酶，没过羊膜，上下颠倒消化清洗；

S3、第一次胰酶消化：①用长镊子捞出羊膜放入玻璃烧杯，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃搅拌消化10min；②长镊子捞出羊膜放入另一玻璃烧杯，弃掉上步骤中的剩余液体，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃搅拌消化30min；③长镊子捞出羊膜放入另一玻璃烧杯，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃继续搅拌消化30min；剩余液体平均分装入6个离心管中，每管加入终止液，细胞筛过滤后4℃，200×g，离心10min；④去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(1.3×10⁸cells)，接种浓度为2×10⁶个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数5％CO2的饱和湿度的培养箱中进行原代培养；

S4、第二次胰酶消化：①从步骤S6中捞出的羊膜加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃继续搅拌消化30min，捞出并弃掉羊膜；②剩余液体平均分装入6个离心管中，每管加入终止液至45mL，细胞筛过滤后4℃，200×g，离心10min；

S5、原代培养：①去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(0.93×10⁸cells)，接种浓度为2×10⁶个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数5％CO₂的饱和湿度的培养箱中进行原代培养；②培养到第3天换液，随后每隔2天换液1次，直至细胞密度达到80％-90％。

2.根据权利要求1所述的羊膜上皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S1中羊膜组织提取的具体步骤为：1、点燃酒精灯，准备好无菌的镊子剪刀、托盘、手套；2、往2个玻璃烧杯中分别倒入生理盐水，带上无菌手套，从采集袋中取出胎盘；3、用一把镊子和剪刀辅助，从胎盘上撕下羊膜；4、放入装有生理盐水的玻璃烧杯中清洗，捞出，放入另一装有生理盐水的玻璃烧杯中再次清洗；5、用长镊子将羊膜拎起，用剪刀剪成5cm左右的小段，放入培养皿中。

3.根据权利要求1所述的羊膜上皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S2-S4中胰酶浓度为0.05％。