[发明专利]一种获得抗原特异性T细胞的方法

说明书

本发明公开了一种获得抗原特异性T细胞的方法，包括如下步骤：步骤一，采集外周血，分离获得单个核细胞PBMC；步骤二，获取未成熟DC细胞；步骤三，刺激诱导未成熟DC细胞成熟；步骤四，分离纯化初始T细胞；步骤五，按照成熟DC细胞：初始T细胞＝1：5‑120的细胞数量比例混合，加入目标抗原共刺激培养，共刺激培养1‑3轮，继续培养5‑128h，得到细胞悬液；步骤六，分离纯化抗原特异性T细胞；采用本方法能有效提高共培养细胞悬液中抗原T细胞占比。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别是一种获得抗原特异性T细胞的方法。

背景技术

目前常用获得抗原特异性T细胞的方法主要是从外周血中分离单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，缩写PBMC)后，将其加入适量培养基后在培养箱中孵育2h，其中所有贴壁细胞被认为是未成熟DC细胞，悬浮细胞被认为是T细胞；将悬浮细胞通过收集洗涤后作为T细胞保存；将目标抗原与贴壁细胞(未成熟DC细胞)共孵育，并通过添加多种细胞因子诱导未成熟DC细胞成熟；然后再将得到的成熟DC细胞与之前收集的T细胞共培养，获得抗原特异性T细胞。但是此方法获得的贴壁细胞仍含有T细胞，从而直接导致得到的成熟DC细胞的纯度低、数量少。且目前通常成熟DC细胞与T细胞仅共培养刺激一轮，使用的是未经纯化的T细胞，其中初始T细胞含量低、纯度不高。但是由于能被成熟DC细胞激活并接收成熟DC细胞所提呈的抗原信息的是初始T细胞，所以在初始T细胞含量低、纯度不高的情况下，最终很难在共培养成熟的DC细胞和未经纯化的T细胞后得到的细胞悬液中有效获得抗原特异性T细胞。因此，市场需要一种能够更有效地获得抗原特异性T细胞的方法，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种获得抗原特异性T细胞的方法，采用本方法能有效提高共培养细胞悬液中抗原T细胞占比。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种获得抗原特异性T细胞的方法，包括如下步骤：

步骤一，采集外周血，分离获得单个核细胞PBMC；

步骤二，获取未成熟DC细胞：

将PBMC离心弃上清，采用免疫磁珠分离试剂盒分离获得未成熟DC细胞，加入缓冲液和免疫磁珠，混匀后避光孵育；再经过多次离心、弃上清，计数重悬；将细胞悬液经分离柱洗脱分离得到未成熟DC细胞和T细胞；

步骤三，刺激诱导未成熟DC细胞成熟：

收集未成熟DC细胞，铺入培养瓶，加DC细胞培养基培养后，加入抗原，再加入生长因子组合；培养后收集成熟DC细胞；

步骤四，分离纯化初始T细胞：

将步骤二得到的T细胞计数，采用免疫磁珠分离试剂盒分离获得初始T细胞，加入缓冲液和免疫磁珠，混匀后避光孵育；再经过多次离心、弃上清，计数重悬；将细胞悬液经分离柱洗脱分离得到非初始T细胞和初始T细胞；

将初始T细胞接种后加入T细胞维持培养基后培养；待收集完步骤三中成熟DC细胞后，再次对培养后的初始T细胞进行计数；

步骤五，共刺激培养激活抗原特异性T细胞：

共刺激培养的方法为：按照成熟DC细胞：初始T细胞＝1：5-120的细胞数量比例混合，加入5-240μg/ml的抗原，共刺激培养；将成熟DC细胞与初始T细胞共刺激培养1-3轮，在最后1轮加入成熟DC细胞和抗原后继续培养5-128h，得到细胞悬液；

步骤六，分离纯化抗原特异性T细胞：

共刺激培养后的细胞悬液进行计数离心弃上清，采用免疫磁珠分离试剂盒分离纯化抗原特异性T细胞，加入缓冲液和免疫磁珠，混匀后避光孵育；再经过多次离心、弃上清，计数重悬；将细胞悬液经分离柱洗脱分离得到非抗原特异性T细胞和抗原特异性T细胞。