[发明专利]一种生产PHB的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种生产PHB的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应用。本发明以运动发酵单胞菌ZM4为出发菌株，首先利用基因工程手段引入外源PHB合成的三个必需基因phaA，phaB，phaC，与四环素诱导型启动子一起构成操纵子Ptet‑phaCAB，整合到ZM4基因组ZMO0038位置得到ZMPt菌株。然后敲除ZMPt菌株基因组上ZMO1082位置的特定核苷酸胸腺嘧啶得到ZMPt‑Flo絮凝菌株。最后依次在ZMPt‑Flo菌株引入pEZ‑Pg^N2，pE39p‑Pe^EUP质粒最终得到菌株ZMPt‑Flo^N2‑EUP。并进行了培养基优化，循环发酵实验生产乙醇及PHB。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种生产PHB的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及其应 用。

背景技术

石油工业生产的塑料具有良好的柔韧性和轻盈等特性，已成为人们生活中不可缺少的商品。然 而，石油来源的塑料生物降解性低、回收和分类复杂，存在严重的环境污染，尤其是对海洋生态系统。 聚-β-羟丁酸(Poly-β-hydroxybutyric,PHB)是一类由微生物合成的高分子聚酯，具有生物可降解性和 生物相容性，因而被认为是环境友好型材料，广泛应用于农业、环保、生物化工、医药、医用材料等 领域。

PHB的生物合成主要是通过微生物自身代谢，其中最主要的是微生物发酵法，也是研究最为广 泛的方法。但是现阶段，大多数的微生物发酵过程是需氧的，需要耗费大量的能量供氧。运动发酵单 胞菌(Zymomonas mobilis)作为一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，具有许多独特的生理特点和优异的工业 生产特性，是目前已知唯一能够在厌氧条件下利用2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(Entner-Doudoroff， ED)途径的微生物，具有较高的糖吸收率、乙醇收率和乙醇耐受性等优良特性。作为一种兼性厌氧 生物，运动发酵单胞菌可以在厌氧条件下发酵，且相较于有氧条件表现更好，从而可以解决微生物发 酵过程面临的供氧难题，如搅拌、通气以及空气灭菌等。目前已经在运动发酵单胞菌中实现了乳酸、 2-3丁二醇，异丁醇等产品的生产。因此，通过基因工程，代谢工程等手段得到运动发酵单胞菌的PHB生产菌株，并结合过程工程手段如絮凝和发酵条件优化等方法进一步提高PHB产量，使运动发酵单 胞菌成为乙醇和PHB生产的高效细胞工厂具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种生产PHB的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法及 其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种生产PHB的自絮凝运动发酵单胞菌的构建方法，将序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的phaC、phaA和phaB，3个外源基因序列按照Ptet-phaC-RBS-phaA-RBS-phaB 的顺序串联得到Ptet-phaCAB操纵子，序列如SEQ ID NO.4所示；利用基因编辑手段，将ZM4基因 组上的ZMO0038基因用Ptet-phaCAB替换，得到菌株ZMPt；删除菌株ZMPt中ZMO1082基因第181 位的核苷酸胸腺嘧啶，得到絮凝菌株ZMPt-Flo。

发明人实验发现phaCAB操纵子位于染色体上比位于质粒中具有更好的生产效果。位于质粒中时， PHB的产量为0.24％DCW，而位于染色体上的ZMPt的PHB的产量为2.07％DCW，产量提高了8.6 倍。

进一步地，用引物zwf-phaC-F与phaB-R扩增Ptet-phaCAB操纵子上的phaCAB片段；将基因zwf 片段与phaCAB片段连接，得到zwf-phaCAB片段；将zwf-phaCAB片段与Pgap启动子连接形成 Pgap-zwf-phaCAB操纵子；将Pgap-zwf-phaCAB操纵子与pEZ-15A反扩载体片段组装得到pEZ-Pg^N2； 将pEZ-Pg^N2转入ZMPt-Flo中，得到ZMPt-Flo^N2；