[发明专利]一种用于肝微核试验的福尔马林固定法

说明书

本发明公开了一种用于肝微核试验的福尔马林固定法。其包含碱处理后研磨组织块获得分散的细胞、使用孔径为30‑50μm的细胞滤网过滤、经离心后用中性福尔马林溶液重悬细胞获得细胞悬液，使用去离子水稀释4000～6000倍后的SYBR GOLD染液对细胞悬液染色。本发明提供的福尔马林固定法实验结果与传统的胶原酶消化法相关性高，检测肝致癌物的灵敏度相当于或高于胶原酶消化法，且能对一般毒理研究中的福尔马林固定肝组织进行回顾性微核分析，同时还有实验方法简单，收获肝细胞多，试验成本低等优点。

技术领域

本发明属于肝微核试验领域，具体涉及一种用于肝微核试验制备肝细胞悬液方法——福尔马林固定法。

背景技术

肝微核(liver micronucleus,LMN)试验是一种有效的检测体内遗传毒性化合物的方法，特别是需要代谢活化的遗传毒性化合物。该方法适用于检测代谢物极不稳定、无法到达遗传学研究经典靶细胞的前致癌物或有致断裂效应的代谢物。

尽管在常规微核试验中，肝脏不是主要的靶组织，但在一般毒理学研究和致癌性检测中，肝脏是一个重要的组织，因为受试化合物在肝脏中被代谢，有时被激活，从而具有毒理学意义。据报道，需要代谢激活或在啮齿动物常规红细胞微核试验中检测不到的遗传毒性啮齿动物致肝癌物可通过肝微核试验检测到。

现有技术中通常使用胶原酶消化法制备肝细胞悬液，例如，文献“大鼠体内多终点实验评价N-亚硝基二乙胺的遗传毒性研究，童文”中公开的肝细胞悬液制备方法就属于胶原酶消化法，并使用DAPI-AO混合染液染色，之后通过显微镜检观察肝细胞微核(micronucleus，MN)数量并计算肝微核率(Hepatocyte micronucleus，MN-HEP％)。日本微核试验协作研究小组(the Collaborative Study Group for the Micronucleus Test,CSGMT)/日本环境致突变学会(Japanese Environmental Mutagen Society,JEMS)/哺乳动物致突变研究组(Mammalian Mutagenicity Study Group,MMS)对胶原酶消化法进行了大量验证。

传统的胶原酶消化法中，获取肝脏后必须及时进行肝细胞悬液的制备；新鲜肝组织中含有的胶原对细胞悬液制备影响很大导致得到的肝细胞量较少；制好的细胞悬液中还含有血细胞干扰阅片过程。

发明内容

现有技术制备肝细胞悬液的过程复杂，制备的肝细胞状态不够好，不利于镜检，而且使用TE缓冲液稀释SYBR GOLD染液后用于染色HEP标本，但TE buffer制备过程繁琐。针对上述缺点，本发明提供了一种福尔马林固定法，其检测肝致癌物的灵敏度相当于或高于胶原酶消化法。本发明的福尔马林固定法还能对一般毒性研究中的福尔马林固定肝组织中进行回顾性评估。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种福尔马林固定法，其包含碱处理后研磨组织块获得分散的细胞、使用孔径为30-50μm的细胞滤网过滤、离心后用中性福尔马林溶液重悬细胞获得细胞悬液，使用去离子水稀释4000～6000倍后的SYBR GOLD染液对细胞悬液染色。

所述SYBR GOLD染液稀释的倍数优选5000倍。

按照本领域常规，本发明方法可用于常用实验类动物，例如大鼠和小鼠。

按照本领域常规，一般来讲，在所述碱处理的步骤前，需要先将获得的组织切成组织块、清洗。在碱处理后、用细胞滤网过滤之前，需要先将碱处理后的组织块碾碎，例如，可以使用注射器胶塞碾碎。

本发明中所述离心的时间、转速可为本领域常规，较佳地：所述离心的时间为1-5min，转速为45-66g。

在本发明一优选实施方案中，所述离心的时间为2min。

在本发明一优选实施方案中，所述离心的转速为50g。