[发明专利]一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法，将目标蛋白与核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的非经典分泌蛋白融合，在梭菌中进行蛋白表达。与现有技术相比，本发明提供了一种全新的方法提高重组蛋白在梭菌中的蛋白表达效率，为优化梭菌中重组蛋白的制备与应用奠定了技术基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法。

背景技术

梭菌(Clostridium acetobutylicum)属革兰氏阳性菌，作为发酵生产ABE(丙酮-丁醇-乙醇)的传统菌株，目前广泛应用于生物能源的生产工艺研发和代谢工程改造中。在该菌株中利用基因工程手段表达目标蛋白的技术已经非常成熟。在大肠杆菌等模式菌株中，研究者可以通过融合一些熟知的蛋白标签、分子伴侣或者其他辅助蛋白的方法来提高目标蛋白的可溶性、稳定性或表达水平，从而提高目标蛋白的表达效率。但是在梭菌中，以往的研究无论是表达单个蛋白还是表达多个蛋白，其蛋白本身的基因只是被简单地进行独自表达，并没有融合辅助蛋白提高表达效率的报道。

根据实验室前期的研究以及相关文献的报道表明，梭菌具有在很多介质表面形成生物被膜的特性，生物被膜是以胞外蛋白质和多糖等为主体的大分子聚合基质，其形成表明细胞具有大量合成、分泌胞外蛋白质的能力。

大多数分泌到细胞外环境中的蛋白质都包含有信号肽分泌序列，但是在细胞外培养基中仍然存在一部分蛋白质不包含任何已知信号或明显的信号肽分泌序列，例如GroES、GroEL、Dna K、Etf A等都是已报道的不包含信号肽序列的分泌蛋白。并且根据相关的报道证明这些普遍存在于细胞外且不包含信号肽的蛋白质并非是通过细胞裂解而出现在胞外环境中。由于蛋白质从细胞内分泌至细胞外的分泌途径尚不明确，因此该类蛋白质被称为非经典分泌蛋白。

通过对梭菌胞外蛋白质组学分析研究发现，其胞外存在大量的蛋白质，利用SignalP 在线分析系统分析，发现仅有少部分的蛋白质包含经典的分泌信号肽，而大多数胞外蛋白质并属于非经典分泌蛋白。本发明通过将非经典分泌蛋白与目标蛋白进行融合表达，可有效地提高目标蛋白在梭菌中的表达效率，进而提升梭菌在工业化生产中的应用价值。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法，即利用基因工程手段将目标蛋白与非经典分泌蛋白融合，在梭菌中进行蛋白表达，以提高目标蛋白在梭菌中的表达效率。

其中，所述的非经典分泌蛋白是指能够存在于细胞外而其编码基因中不含有信号肽序列的蛋白质。本发明中非经典分泌蛋白的分离鉴定方法为：收集梭菌形成的生物被膜(biofilm)，采用专利(中国发明专利ZL 201610580986.3)所述的方法分离出胞外蛋白，或者收集梭菌细胞的培养液，离心后收集含有胞外蛋白的上清液；对所得到的蛋白样品采用蛋白质双向电泳(2D)或蛋白质组学分析技术进行鉴定，最终得到能够存在于细胞外而编码基因中不含信号肽序列的蛋白质。